微波預處理條件對蘋果汁品質(zhì)的影響

張婷婷 蒲云峰 劉 懿 葉興乾 劉東紅，2*

（1 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 杭州310058 2 浙江大學馥莉食品研究院 杭州310058）

蘋果為薔薇科（Rosacea）蘋果屬（Malus Mill）多年生木本植物， 是我國栽培歷史最久、 面積最大、產(chǎn)量最高的果樹[1]。 蘋果富含可溶性糖、氨基酸、有機酸、膳食纖維和微量元素等營養(yǎng)成分，此外，還含有大量黃酮、酚酸、原花色素三萜類等功能活性成分[2-3]。 據(jù)2018年中國統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)，我國蘋果產(chǎn)量達到3 923.3 萬t。目前，蘋果除了鮮食外，主要用于蘋果汁加工。 然而，蘋果中多酚氧化酶活性高，在蘋果汁加工過程中易發(fā)生酶促褐變，導致蘋果汁產(chǎn)品色澤加深，商品價值降低。

目前，除了傳統(tǒng)的熱處理方法，在預防果汁褐變方面，研究人員已做多種嘗試。 Sun 等[4]發(fā)現(xiàn)超聲處理鮮榨蘋果汁，可抑制果汁褐變。 Bi X 等[4]采用脈沖電場對蘋果汁進行處理， 發(fā)現(xiàn)隨著脈沖電場強度的增強以及脈沖上升時間的增加， 多酚氧化酶的活性也隨之降低。 Du Y 等[6]研究得出0.1 mmol/L 植酸能夠同時降低蘋果汁酶促褐變和非酶促褐變，從而延長蘋果汁的貨架期。 Suh 等[7]發(fā)現(xiàn)從皺葉酸模種子中提取的天然化學物質(zhì)能夠抑制鮮榨蘋果汁的褐變。Klimczak 等[8]采用不同濃度的綠茶提取物抑制混濁蘋果汁的褐變， 發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高， 在短存儲期內(nèi)對混濁蘋果汁褐變的抑制效果較好。

從現(xiàn)有文獻來看， 現(xiàn)有的技術(shù)均能夠有效滅酶或抑制酶活，從而降低蘋果汁褐變程度。這些研究均以蘋果榨汁后的蘋果汁為研究對象， 忽視了打漿和制汁過程可能發(fā)生酶促褐變。 與傳統(tǒng)熱處理方法相比， 微波處理能極大地縮短加熱時間并保持食品的天然品質(zhì)[9]。 Marsza?ek 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，微波處理可以更好地保持草莓醬的品質(zhì)及色澤。張少穎等[11]發(fā)現(xiàn)微波預處理蘋果塊能有效抑制果汁褐變。本文提出采用微波處理對蘋果整果滅酶，然后制備蘋果汁， 以期為有效控制蘋果汁酶促褐變提供一種新的加工方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇成熟度相同、外觀無損傷及明顯病蟲害、大小均勻， 質(zhì)量范圍在200～250 g 的中等大小新鮮富士蘋果，洗凈待用。

交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮 （PVPP，USP 級）、2，6-二氯靛酚鈉鹽水合物 （＞95.0%）、Triton X-100（生化級）、聚乙二醇6000，阿拉??；福林酚試劑（生化試劑）、三水合乙酸鈉（分析純）、二水合草酸（優(yōu)級純）、鄰苯二酚（化學純）、無水碳酸鈉（分析純）、醋酸（優(yōu)級純）、濃鹽酸（優(yōu)級純）、氯化鐵（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；水溶性維生素E（Trolox）、2， 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2， 4， 6-三（ 2-吡啶基）三嗪（TPTZ），美國Sigma 公司。

1.2 設(shè)備與儀器

JYL-D022 型多功能全自動果汁機，九陽股份有限公司；微波爐（W25800k-01AG），寧波方太廚具有限公司； 超聲波清洗裝置 （50Hz， 功率240 W），深圳市吉利特超聲洗凈設(shè)備有限公司； PHS-550 型pH 計， 陸恒生物；1510 型全波長酶標儀，Thermo Fisher；UV-2550 紫外分光光度計，日本島津公司；ColorFlex EZ 色差儀， 鼎韻中國公司；高效液相色譜儀，沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

微波滅酶處理： 將新鮮蘋果洗凈， 置微波爐中，微波處理后迅速置4 ℃冰箱冷卻60 min。 蘋果中心溫度情況見表1 所示（因蘋果多酚氧化酶的失活與溫度密切相關(guān)， 故測其中心溫度變化情況）。加入與蘋果等質(zhì)量的水，切塊、去核、打漿。用4 層紗布過濾得到蘋果濁汁。

微波處理功率為480，640，800 W， 處理時間為120，140，160，180 s（微波處理時間過長，使蘋果皺縮破裂，導致水分流失，本試驗將處理的最長時間設(shè)為180 s）。 共12 組微波處理，本試驗每組重復3 次，總共36 個樣品。 未經(jīng)處理的樣品作為空白組（記為CK）與之對比。

表1 不同微波條件下的蘋果中心溫度情況（℃）Table 1 The central temperature （℃）of apple under different microwave conditions

1.3.1 色澤的測定[12]采用色差儀測定30 mL 果汁的L*、a*、b*值。 褐變指數(shù)（BI）根據(jù)以下公式計算：

式中：X=（a*+1.75L*）/（5.645L*+a*-3.012b*）

1.3.2 多酚氧化酶的測定 參考曹建康[13]的方法。 取5 mL 提取緩沖液（含1 mm PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）于10 mL 果汁中，搖勻，4 ℃下離心10 min， 取上清液100 μL 加入3 mL 0.2 mol/L 鄰苯二酚緩沖液， 于波長420 nm 處測吸光度變化。 以每升樣品每分鐘吸光度變化值增加1為1 個活性單位。

1.3.3 總酚含量的測定[14]稱取10 mL 果汁與20 mL 甲醇勻漿， 定容50 mL， 然后超聲30 min，離心，備用。 在10 mL 試管中，先加0.6 mL 提取液，然后加1 mL 福林酚試劑， 混勻靜置5 min 后，加3 mL 0.1 mol/L 碳酸鈉，最后用蒸餾水定容，充分混勻后避光反應(yīng)2 h， 于波長760 nm 處測定吸光值。

1.3.4 可溶性醌含量的測定[15]取1.3.3 節(jié)離心后的上清液于波長437 nm 處測其吸光度。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 FRAP 法 準確移取20 μL 樣液于96 孔板中，加入配好的150 μL TPTZ 工作液，37 ℃震蕩反應(yīng)10 min，測定波長593 nm 處的吸光值。 根據(jù)標準曲線計算樣品的總抗氧化能力， 結(jié)果用等價抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC，mg/L）。

1.3.5.2 ABTS 法 準確移取 20 μL 樣液于96孔板中， 加入配好的170 μL ABTS 工作液，37 ℃震蕩反應(yīng)10 min， 測定波長734 nm 處的吸光值。根據(jù)標準曲線計算樣品的總抗氧化能力， 結(jié)果用等價抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC， mg/L）。

1.3.6 高效液相法測定蘋果汁中酚類化合物含量 樣品儲備液的制備： 將上述總酚測定粗提取液經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾，得樣品儲備液。

色譜條件：色譜柱：Spursil C18 （250 mm×4.6 mm）；流動相：甲酸-甲醇溶液（20 ∶80，V/V）；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：0.7 mL/L； 流動相梯度洗脫條件見表2[16]。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution steps

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗各處理均重復3 次， 求其平均值和標準差，結(jié)果用x±s 表示。 用SPSS 軟件進行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波預處理對蘋果汁褐變的影響

圖1 微波預處理對蘋果汁褐變指數(shù)的影響Fig.1 Effect of the microwave pretreatment on browning index of apple juice

2.1.1 微波預處理對蘋果汁褐變指數(shù)的影響 作為褐變的信號之一， 褐變指數(shù)的上升意味著褐變程度的加深[17]。 由圖1 可知，微波組褐變指數(shù)顯著低于CK 組（P＜0.01）。可見微波預處理能更好地抑制蘋果汁褐變，且微波功率越高，處理時間越長，褐變抑制效果越好。 在140 s 時，480，640 W 和720 W 功率處理的果塊， 其果汁褐變指數(shù)分別比CK 降低54.4%，65.7%及69.9%。 在微波功率800 W，處理時間超過140 s 時，褐變指數(shù)變化不顯著（P＞0.05）， 這可能與微波時間延長導致的蘋果中心溫度過高，處理過度，進一步引發(fā)劇烈的美拉德反應(yīng)有關(guān)[12]。

2.1.2 微波預處理對蘋果汁多酚氧化酶活性的影響 多酚氧化酶（PPO）是一種促進酶促褐變的含銅酶。PPO 可分為兩類：漆酶（EC 1.10.3.2）及分布在植物中的多酚氧化酶（EC 1.10.3.1）[18]。 在氧氣存在條件下，多酚氧化酶催化兩個反應(yīng)：一是單酚的羥基化，二是鄰苯二酚氧化為鄰苯二醌。果汁生產(chǎn)加工過程中，打漿、破碎、均質(zhì)等環(huán)節(jié)均會引入空氣，從而導致蘋果內(nèi)酚類物質(zhì)被氧化。由圖2 可知，隨著微波功率的增大以及時間的延長，微波預處理對多酚氧化酶活性的抑制效果明顯。此外，蘋果中心溫度隨著微波功率的增大及時間的延長而增高（見表1）。 在微波800 W，180 s 條件下，蘋果中心溫度為96.7 ℃， 冷藏1 h 后中心溫度為58.1℃，對PPO 起到較好的滅酶作用，此時PPO 活性僅為CK 組的19.6%。 Valadez-Carmona L 等[19]發(fā)現(xiàn)微波加熱能使可可莢殼內(nèi)PPO 活性降低66%。Zhou L 等[20]采用不同微波功率處理鱷梨醬，發(fā)現(xiàn)微波功率密度越高， 對PPO 活性抑制效果越明顯，說明微波預處理能達到滅酶效果。

圖2 微波預處理對蘋果汁多酚氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of the microwave pretreatment on polyphenol oxidase activity

2.1.3 微波預處理對蘋果汁可溶性醌的影響 作為酶促褐變的產(chǎn)物之一， 可溶性醌的增加在一定程度上意味著蘋果汁中黑色素的累積。 由圖3 可知， 通過比較微波功率一致而處理時間不同對果汁可溶性醌的影響，發(fā)現(xiàn)在微波功率480 W 時，隨著微波時間的延長，可溶性醌含量下降顯著（P＜0.05）， 時間延長至180 s， 其可溶性醌含量降低84.1%，說明該條件下微波時間越長對褐變的抑制效果越好， 而在微波功率640 W 及800 W 時，可溶性醌含量隨時間變化不大。 進一步觀察同一微波時間下不同功率對可溶性醌的影響， 發(fā)現(xiàn)微波功率640 W 和800 W 的可溶性醌含量明顯低于480 W 處理的樣品。 可見，在一定范圍，隨著微波功率的增大及時間的延長， 對蘋果汁褐變的抑制效果越好。

2.2 微波預處理對蘋果汁營養(yǎng)品質(zhì)的影響

圖3 微波預處理對蘋果汁可溶性醌含量的影響Fig.3 Effect of the microwave pretreatment on polyphenol soluble quinone

2.2.1 微波預處理對蘋果汁總酚含量的影響 作為次生代謝產(chǎn)物， 蘋果多酚包括酚酸和類黃酮類成分[21]。 蘋果中的酚酸主要有綠原酸、阿魏酸、咖啡酸等；而蘋果中的類黃酮類主要包括兒茶素、表兒茶素及槲皮素等。 由圖4 可知，在同一功率下，隨著時間的延長，總酚含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這可能是溫度過高， 導致熱不穩(wěn)定性物質(zhì)被破壞[22]。在功率480，640 W 及800 W 下，蘋果汁中總酚含量分別在處理時間160，160 s 及140 s 達到最高，在微波800 W、140 s 條件下總酚含量達到3 456 mg/kg，是對照組的2.2 倍。 這說明微波預處理使PPO 在接觸空氣之前被大量滅活，導致果汁中酚類底物未被大量氧化。另外，微波處理可能破壞細胞壁，導致細胞質(zhì)溶出，從而促進細胞內(nèi)大量酚類物質(zhì)的釋放。

圖4 微波預處理對蘋果汁總酚含量的影響Fig.4 Effect of the microwave pretreatment on total phenols

2.2.2 微波預處理對蘋果汁主要酚類物質(zhì)含量的影響 由表3 可知， 蘋果汁中含量較高的小分子酚類物質(zhì)如綠原酸、兒茶素、表兒茶素等經(jīng)微波預處理后其含量均顯著升高（P＜0.05）。 微波640 W、160 s 條件下，綠原酸含量為空白處理的9.1 倍。研究微波功率及時間變化對綠原酸的影響， 可看出綠原酸含量隨功率的升高及時間的延長呈先上升后下降趨勢。 這可能是由于微波處理初期較高的溫度導致蘋果細胞破裂， 加速液泡內(nèi)酚類物質(zhì)的溶出，使得綠原酸含量升高，然而繼續(xù)增大功率并延長時間， 微波引發(fā)的熱效應(yīng)使得具有不穩(wěn)定性的綠原酸含量減少。觀察兒茶素及表兒茶素，其含量變化趨勢與綠原酸相近。與綠原酸相反，蘋果汁中蘆丁等黃酮類物質(zhì)經(jīng)微波處理后含量顯著降低（P＜0.05）。Huang 等[23]發(fā)現(xiàn)采用蒸汽加熱法處理甘薯導致總黃酮含量減少了25%?？梢?，蘆丁等物質(zhì)含量的降低可能與其不耐熱性密切相關(guān)。

2.3 微波預處理對蘋果汁抗氧化能力的影響

由于反應(yīng)機制和特性差異， 所以抗氧化能力測定通常使用兩種及以上方法[24]。 采用ABTS 及FRAP 評價不同微波條件下蘋果汁的抗氧化能力。由圖5 可知， 在微波時間120～160 s 范圍，3 個功率條件下抗氧化能力與功率及時間呈正相關(guān)。 而微波時間為180 s 時， 微波功率800 W 處理的樣品的抗氧化能力小于640 W 處理的樣品，這可能與該條件下總酚含量下降有關(guān)。為驗證這一假設(shè)，評估這兩種抗氧化能力與總酚之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示， 總酚與ABTS 及FRAP 均有較為顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.740（P＜0.01）和0.838（P＜0.01）。 上述相關(guān)性分析表明蘋果汁中酚類物質(zhì)是蘋果汁抗氧化能力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 而微波預處理則能顯著提高蘋果汁的抗氧化能力 （P＜0.05）。

表3 微波條件對蘋果汁主要酚類物質(zhì)含量的影響（mg·kg-1）Table 3 Effect of the microwave treatment on main single phenolic composition （mg·kg-1）of apple juice

2.4 微波預處理對蘋果汁各指標的影響

以功率（480，640，800 W）和時間（120，140，160，180 s）及空白對照為X 變量，15 個果汁指標為Y 變量作PLS2 分析，結(jié)果如圖6 所示。 不同微波預處理條件對蘋果汁各指標的影響是多維的復雜的數(shù)據(jù)信息。為了簡潔、清楚地呈現(xiàn)樣品智能感官特征， 利用化學計量學工具對復雜而龐大的多維數(shù)據(jù)進行處理。 主成分分析（principal components analysis，PCA）是一種無監(jiān)督分析，可在未知樣品分類信息的情況下將樣品聚類分組。 PCA通過將多指標（多維）的信息進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維， 對降維后的特征向量進行線性分類， 然后在PCA 得分圖上顯示主要的二維得分圖。 由圖6 可知PC1 和PC2 分別為97%和2%， 共貢獻率為99%。 一般認為所得主成分總貢獻率超過85%時此方法可使用?？傌暙I率越大，主成分對原來多指標信息的反應(yīng)效果越好。由圖6 可知，不同處理樣品的差異主要體現(xiàn)在第1 主成分。 其中空白處理與褐變指數(shù)、多酚氧化酶活性較近，與多數(shù)酚類物質(zhì)較遠，說明未經(jīng)處理的蘋果汁存在褐變問題；而不同微波預處理條件中， 微波條件640 W、160 s，800 W、140 s，800 W、160 s 與酚類物質(zhì)近，與褐變指數(shù)、多酚氧化酶活性遠，說明這3 個條件能較好地抑制褐變， 在一定程度上提升蘋果汁的營養(yǎng)品質(zhì)。其中，800 W、140 s 用時較短，距酚類物質(zhì)更為接近，從節(jié)能角度考慮，選擇微波條件800 W、140 s 作為抑制蘋果汁褐變的較優(yōu)條件。

圖5 ABTS 法（A）和FRAP（B）法測定不同微波條件下蘋果汁的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant activity of apple juice determined by ABTS （A）and FRAP （B）at different microwave pretreat

圖6 PLS2 分析的二維主成分效果圖Fig.6 The PLS2 correlation loadings plot

3 結(jié)論

目前， 市場上常見的蘋果汁產(chǎn)品為蘋果清汁及蘋果濁汁[25-26]。 蘋果清汁經(jīng)歷酶解、澄清過濾等過程， 造成果汁中部分有益于人體的酚類、 蛋白質(zhì)、纖維素等損失，而濁汁含有較多的果膠、蛋白質(zhì)以及纖維素等，營養(yǎng)價值高于清汁[27]。 蘋果汁的褐變主要包括酶促褐變及非酶褐變。 非酶褐變主要發(fā)生在貯藏過程中， 通常歸因于抗壞血酸和美拉德反應(yīng)，由于高糖和低抗壞血酸含量，所以引起蘋果汁貯藏過程中非酶褐變的主要原因為美拉德反應(yīng)[28]。 酶促褐變主要發(fā)生在加工過程中，酚類物質(zhì)在氧氣存在的情況下將氧化為醌[29]。 蘋果汁的褐變伴隨著色澤的改變，營養(yǎng)價值的流失，最終導致商品價值下降。 本文研究經(jīng)不同微波條件預處理所得蘋果汁的褐變及品質(zhì)特性，得出以下結(jié)論：

1）抑制褐變方面 與空白組相比，微波預處理能顯著降低蘋果汁的褐變指數(shù)， 抑制多酚氧化酶活性且有效降低果汁中可溶性醌的含量（P＜0.05）。

2）蘋果汁營養(yǎng)品質(zhì)方面 微波預處理能顯著提高果汁中總酚及酚類物質(zhì)的含量（P＜0.05）。

3）蘋果汁抗氧化能力方面 與空白對照相比，微波預處理能顯著提高蘋果汁抗氧化能力（P＜0.05）。

4）經(jīng)主成分分析，微波條件800 W、140 s 可作為抑制蘋果汁褐變的較優(yōu)條件。