阿魏菇凝集素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫活性的影響

劉 陽(yáng) 許程劍，2* 林 丹 梁鵬娟

（1 四川旅游學(xué)院食品學(xué)院 成都610100 2 石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子832000）

凝集素（Lectin）是專(zhuān)一識(shí)別糖并與特定結(jié)構(gòu)糖分子可逆、非共價(jià)結(jié)合的糖蛋白或蛋白質(zhì)，從植物、動(dòng)物、微生物中皆可以分離得到[1]。Yoon 等[2]研究發(fā)現(xiàn)從韓國(guó)槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai]中分離的凝集素具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強(qiáng)宿主對(duì)抗腫瘤的防御系統(tǒng)， 對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療效果與NK 細(xì)胞（natural killer，NK）和巨噬細(xì)胞的活化相關(guān)。研究表明，大量大型真菌均具有一定凝集素活性[3]，可抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)機(jī)體免疫活性，如阿魏菇[4]、猴頭菌[5]、牛樟芝[6]、杏鮑菇[7]等。 在食品領(lǐng)域凝集素一直是各國(guó)學(xué)者研究的重點(diǎn)[8-10]。

阿魏菇作為目前食用菌中營(yíng)養(yǎng)含量最高的一種， 其蛋白質(zhì)含量高達(dá)14.9%， 富含不飽和脂肪酸，并含有豐富的維生素及多種礦物質(zhì)[11]，是食用與藥用價(jià)值并存的珍貴菌類(lèi)。 李娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)食用阿魏菇有助于減輕宮頸癌患者化療后的不良反應(yīng)，增強(qiáng)對(duì)化療的耐受力。Gong 等[13]研究發(fā)現(xiàn)阿魏菇多糖可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用，進(jìn)而增強(qiáng)其免疫活性，達(dá)到抗腫瘤的目的。目前鮮有報(bào)道顯示阿魏菇凝集素的免疫活性。 本文基于真菌凝集素的研究現(xiàn)狀， 采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從阿魏菇中分離得到凝集素， 通過(guò)凝集素與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)，檢測(cè)蛋白的免疫生理活性，探討真菌凝集素在藥用真菌中存在的特點(diǎn)和普遍性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏菇，采至新疆清河縣。 昆明種小鼠，石河子大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

二乙氨基乙基纖維素52、 瓊脂糖凝膠4B，上海圓創(chuàng)生物科技有限公司； 小鼠TNF-α、IL-1 Elisa 試劑盒，北京誠(chéng)林生物科技有限公司；噻唑藍(lán)MTT 、RPMI-1640 培養(yǎng)基， 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

ENK-PRO 型酶標(biāo)儀， 美國(guó)Bioteck 公司；BT-200E 型恒流泵，上海琪特分析儀器有限公司；BSZ160-LCD 型自動(dòng)部分收集器， 上海琪特分析儀器有限公司；Ultrospec-5300 型紫外分光光度儀，美國(guó)Amersham 公司；真空冷凍干燥系統(tǒng)，日本SHIMADZU；BPN-50CH（UV）二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 PFLL 的分離純化 取濕重200 g 的新鮮阿魏菇， 打漿后加入pH 7.2 的PBS 緩沖液1 000 mL，浸泡1 d，次日8 000 r/min 離心20 min，取上清液。 用硫酸銨沉淀蛋白[14]，過(guò)夜后8 000 r/min 離心20 min。取沉淀重新溶解于硫酸銨溶液中，透析2 d，冷凍干燥后得粗品。

將粗品溶解后，過(guò)DEAD-52 柱，分別用0.1，0.2，0.3，0.4 mol/L 和0.5 mol/L NaCl 洗脫，于波長(zhǎng)280 nm 處測(cè)定吸光度值， 按洗脫峰收集合并組分。 過(guò)Sepharose 4B 層析柱，收集有峰值的組分，檢測(cè)凝血活性。 將有凝血活性的組分合并后的凝集素透析，冷凍干燥得到高純度凝集素PFLL。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠于3 d 前腹腔注射1 mL 小牛血清。 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天頸椎脫臼處死小鼠，于醫(yī)用酒精中浸泡5 min，打開(kāi)腹部皮肽， 腹腔注射無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)基15 mL，輕揉腹部10 min，收集腹腔中的培養(yǎng)基，1 000 r/min 離心5 min， 用無(wú)血清RPM I-1640 培養(yǎng)基離心洗滌2 次[15]，再用含血清RPMI-1640 培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/mL。 將調(diào)整好的細(xì)胞懸液按每孔100 μL 加入96 孔培養(yǎng)板， 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)2 h，吸棄培養(yǎng)液， 除去未貼壁的細(xì)胞， 然后加入新鮮的培養(yǎng)基，即巨噬細(xì)胞。以不同質(zhì)量濃度的PFLL（10，20，30，40 μg/mL 和50 μg/mL）與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，于空白組加入無(wú)血清培養(yǎng)液10 μL。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性的檢測(cè) 提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×106個(gè)/mL。 在培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同質(zhì)量濃度的PFLL（0，10，20，30，40 μg/mL 和50 μg/mL）和10 μg/mL LPS，并設(shè)置空白對(duì)照組和LPS 刺激組（10μg/mL）[15]。每個(gè)濃度3 個(gè)重復(fù)孔，將細(xì)胞于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。 實(shí)驗(yàn)前，每孔分別加入2 μL 5 μg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。 培養(yǎng)結(jié)束后輕扣去除液體培養(yǎng)基， 每孔加入150 μL DMSO， 震蕩10 min，于波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)定OD 值。 以O(shè)D 值為衡量標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)胞增殖情況。 空白對(duì)照組為加入無(wú)血清培養(yǎng)液10 μL。

1.3.4 NO 生成量的檢測(cè) 用Griess 重氮化反應(yīng)法試劑盒檢測(cè)。 取待測(cè)上清100 μL，加入96 孔板中，每孔加50 μL Griess 試劑A，輕輕震蕩，反應(yīng)10 min 后加入50 μL Griess 試劑B，輕輕震蕩，反應(yīng)10 min 后于波長(zhǎng)550 nm 處檢測(cè)OD 值。

1.3.5 O2-生成量的檢測(cè) 有關(guān)O2-生成量的檢測(cè)，將小鼠分成9 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 所有對(duì)照組注射無(wú)菌PBS （pH 7.2～7.4）。腹腔注射PFLL 溶液。7 d 后收集細(xì)胞至24 孔板， 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/孔，然后依照之前的方法收集貼壁巨噬細(xì)胞。 兩組巨噬細(xì)胞（5×105個(gè)/mL）與HBSS（Hank’s 平衡鹽溶液）標(biāo)準(zhǔn)液和高鐵細(xì)胞色素C 的混合物 （80 μmol/mL）共同培養(yǎng)[8]，分別添加或者不添加PMA（1 μg/mL）。 在波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定OD 值，消光系數(shù)=2.1×104/（m·cm）。

1.3.6 TNF-α、IL-1 的檢測(cè) 依靠酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）測(cè)定上述物質(zhì)。 測(cè)定工具為專(zhuān)用試劑盒， 使用方法如下：將試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫，取出所需反應(yīng)板； 對(duì)反應(yīng)板每孔加入10 μL 標(biāo)準(zhǔn)品、10 μL 樣品，每孔再加入40 μL 樣品稀釋液，輕輕混勻30 s，封住板孔，37 ℃溫育30 min。洗板：甩干板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（48 孔）（20 倍洗滌液，用前應(yīng)稀釋至1 倍），反復(fù)洗滌5 次，每孔加入酶，輕輕混勻10 s，37 ℃溫育30 min。洗板（洗去未結(jié)合的反應(yīng)物）：甩干板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板，去除水滴；反復(fù)洗滌5 次；每孔加入顯色液A 50 μL， 再加入顯色液B 50 μL， 避光溫育15 min；每孔加入100 μL 終止液，輕輕混勻30 s；在30 min 內(nèi)于波長(zhǎng)450 nm 處讀取OD 值。 以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)， 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)樣品的OD 值， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)重讀3 次， 數(shù)據(jù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。采用方差分析和t 檢驗(yàn)來(lái)確定其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.01）。 數(shù)據(jù)分析和圖形繪制用Spass 18.0 和Origin 8.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFLL 的分離和純化

2.1.1 DEAE-52 離子交換層析洗脫曲線 阿魏菇經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、冷凍干燥等步驟分離出凝集素粗品。將凝集素粗品進(jìn)行DEAE-52 離子交換層析，建立洗脫曲線。由圖1 可知洗脫過(guò)程分別在35 min 和95 min 處有兩個(gè)明顯的洗脫峰，收集兩部分的洗脫液透析除鹽， 通過(guò)凝血試驗(yàn)測(cè)得35 min 處的洗脫液具有更好的凝血活性， 因此收集35 min 處的洗脫液進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.1.2 Sepharose-4B 親和層析洗脫曲線 將DEAE-52 離子交換層析35 min 處的洗脫液進(jìn)行Sepharose-4B 親和層析， 通過(guò)PBS 平衡、D-半乳糖解吸附。 如圖2 所示，在210 min 時(shí)出現(xiàn)峰值，收集此處洗脫液透析并冷凍干燥得高純度的阿魏菇凝集素。

圖1 PFLL 的DEAE-52 離子交換層析圖Fig.1 DEAE-cellulose chromatogram of crude extract PFLL

圖2 PFLL 的Sepharose-4B 親和層析圖Fig.2 Sepharose-4B affinity chromatography of PFLL

2.2 PFLL 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性的影響

MTT 法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。MTT 的四氮唑環(huán)可被活細(xì)胞線粒體的SDH 催化形成MTT-甲瓚復(fù)合物，該復(fù)合物濃度的變化反映了細(xì)胞的增殖活性[14]。 為了研究阿魏菇凝集素對(duì)巨噬細(xì)胞的體外調(diào)節(jié)作用， 用阿魏菇凝集素同巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，根據(jù)不同PFLL 添加量時(shí)吞噬細(xì)胞吸光度大小確定PFLL 對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的影響。圖3a 顯示，添加PFLL 的巨噬細(xì)胞增殖活性皆高于空白對(duì)照組，表明小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在PFLL的誘導(dǎo)下增值活性明顯提高，且隨著PFLL 濃度的升高其增值活性明顯增加。 圖3b 所示，巨噬細(xì)胞增值活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升， 說(shuō)明凝集素能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖作用， 刺激巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，使之成為活化的巨噬細(xì)胞，從而顯著提高其吞噬能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示PFLL 對(duì)巨噬細(xì)胞增值的影響呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。Ajit 等[16]首次發(fā)現(xiàn)小麥胚芽凝集素對(duì)巨噬細(xì)胞有直接影響， 且小麥胚芽凝集素對(duì)巨噬細(xì)胞增值的影響同樣呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。

圖3 PFLL 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Effect of PFLL on proliferation activity in mice peritoneal macrophage

2.3 PFLL 對(duì)NO 誘導(dǎo)的劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性

由圖4a 可知，阿魏菇凝集素刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 的量， 與空白對(duì)照組相比，PFLL（20 μg/mL）組出現(xiàn)顯著差異。 隨著凝集素濃度的升高，巨噬細(xì)胞NO 產(chǎn)生量增加。 由圖4b 可知，阿魏菇凝集素能夠增加LPS 刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的NO 產(chǎn)生量，與空白對(duì)照組相比，從LPS（10 μg/mL）+PFLL（10 μg/mL）組開(kāi)始隨著凝集素濃度的升高，巨噬細(xì)胞NO 產(chǎn)生量增加，PFLL 對(duì)NO 產(chǎn)生量的影響呈劑量依賴(lài)性。 巨噬細(xì)胞可受多種細(xì)胞因子及LPS 誘導(dǎo)活化，產(chǎn)生并釋放大量NO，從而起到抑制或殺傷的作用， 同時(shí)還可通過(guò)釋放溶酶體酶及細(xì)胞毒性因子對(duì)組織器官造成損害[17]。 在內(nèi)毒素引起的休克和多臟器功能衰竭中，NO 是重要的炎性介質(zhì)之一。 有效控制NO 的合成和釋放，進(jìn)一步減輕NO 的細(xì)胞毒作用， 對(duì)免疫性疾病等的治療具有重要意義。

圖4 PFLL 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO 的影響Fig.4 Effect of PFLL on NO secretion in peritoneal macrophage

2.4 PFLL 對(duì)O2-生成量的影響

PFLL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生O2-的結(jié)果如圖5 所示。 在已知的O2-生成過(guò)程中，PMA 是公認(rèn)的信號(hào)物質(zhì)。 由圖5a 可知， 加入PMA 的PFLL （0～400 mg/kg）溶液誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生O2-的量為18～38 nmol/mg 細(xì)胞蛋白， 而未添加PMA 只添加PELL的O2-的量為9～16 nmol/mg 細(xì)胞蛋白。 圖5b 表明在60 min 后， 經(jīng)PFLL 處理的小鼠， 巨噬細(xì)胞的O2-的生成量比未處理的高150%（P≤0.01）。另外，經(jīng)PMA 處理的小鼠在各個(gè)水平， 巨噬細(xì)胞的O2-的生成量都比未處理的高，而僅高40%。由于巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)細(xì)胞， 活化的巨噬細(xì)胞可更加有效地為細(xì)胞呈遞抗原， 感染期間更好地吞噬外來(lái)顆粒， 形成更好的宿主防御機(jī)制[18-19]。PFLL 可以增強(qiáng)其吞噬功能，說(shuō)明在治療微生物感染和癌癥方面，PFLL 具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 PFLL 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞生成O2-的影響Fig.5 Effect of PFLL on the production of O2- in mice peritoneal macrophage

2.5 PFLL 對(duì)TNF-α 生成量的影響

由圖6 可知，PFLL 能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的TNF-α 產(chǎn)生量， 與空白對(duì)照組相比，10 μg/mL 組就出現(xiàn)顯著差異。 隨其濃度的升高，巨噬細(xì) 胞TNF-α 產(chǎn)生量也增加，TNF-α產(chǎn)生量對(duì)PFLL 呈劑量依賴(lài)性，然而在試驗(yàn)范圍均比LPS 組低。 在固定PFLL 濃度下，TNF-α 產(chǎn)生量呈時(shí)間依賴(lài)性，24 h 后具有顯著性差異。TNF-α 主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌， 它可活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞的殺傷活性；同時(shí)也可通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞MHCII 類(lèi)分子， 提高其抗原遞呈能力；還可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，提高超氧陰離子的分泌，增強(qiáng)ADCC 功能[20]。

圖6 凝集素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α 的影響Fig.6 Effect of Lectin on TNF-α secretion in peritoneal macrophage

2.6 PFLL 對(duì)IL-1 生成量的影響

由圖7a 可知， 在不同劑量的PFLL 作用下，IL-1 的生成量呈劑量依賴(lài)性。 在PFLL 為50 μg/mL 時(shí)與LPS 為10 μg/mL 作用， 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1 量接近。 觀察圖7b 可知，PFLL 誘導(dǎo)IL-1 的產(chǎn)生呈時(shí)間依賴(lài)性，IL-1 生成量均高于對(duì)照組，且60 h 后生成量繼續(xù)增加。 石玉榮等[21]研究發(fā)現(xiàn)共同培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和肺癌細(xì)胞時(shí)， 巨噬細(xì)胞可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖， 同時(shí)肺癌細(xì)胞可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞IL-1 的表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬。 多個(gè)研究[22-24]也表明IL-1 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。 本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了這一結(jié)論。

圖7 凝集素對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-1 的影響Fig.7 Effect of Lectin on IL-1 secretion in peritoneal macrophage

3 結(jié)論

對(duì)阿魏菇凝集素提取、 純化后， 得到純品PFLL。 測(cè)定了PFLL 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)幾種細(xì)胞因子NO、O2-、TNF-α、IL-1 生成的結(jié)果。 在PFLL 的作用下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO、O2-、TNF-α、IL-1 顯示出劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。 試驗(yàn)結(jié)果表明PFLL 可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫活性，并具有潛在的免疫調(diào)節(jié)的輔助作用。 IL-1 具有抑制細(xì)胞生產(chǎn)和殺滅細(xì)胞的能力。 TNF-α 直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性， 可促進(jìn)T 細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子。 上述細(xì)胞因子都由活化的巨噬細(xì)胞釋放。 以上研究一方面為凝集素促進(jìn)細(xì)胞因子在mRNA 水平的表達(dá)及其調(diào)控奠定了基礎(chǔ)， 另一方面對(duì)于阿魏菇凝集素的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。