安普那韋與人血清白蛋白之間的相互作用

張楠 陳建波

摘 ?要： 在體外模擬人體生理環(huán)境，采用光譜法并結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，研究了安普那韋與人血清白蛋白（HSA）之間的相互作用.熒光光譜表明：安普那韋可以增強(qiáng)HSA的熒光強(qiáng)度.通過對(duì)結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)常數(shù)的計(jì)算可知，安普那韋和HSA之間的作用力主要是疏水和靜電作用力;紫外-可見光譜顯示：安普那韋能夠增加HSA的吸收峰強(qiáng)度，表明兩者之間發(fā)生了相互作用.三維熒光光譜也顯示：加入安普那韋后，HSA的斯托克斯位移從62 nm增加到了86 nm，說明安普那韋可以使HSA的微環(huán)境極性增加，疏水性減弱;從圓二色光譜的研究結(jié)果可知：隨著安普那韋的加入，HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從18.38%增加到了63.62%，說明安普那韋的存在改變了HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu).分子對(duì)接研究結(jié)果表明：安普那韋與HSA的作用位點(diǎn)位于HSA的ⅡA結(jié)構(gòu)域，而同步熒光光譜的分析進(jìn)一步證明了這一點(diǎn).研究結(jié)果為進(jìn)一步研究安普那韋在體內(nèi)與血清白蛋白的相互作用提供了一定的理論參考.

關(guān)鍵詞： 人血清白蛋白（HSA）; 安普那韋; 相互作用; 光譜法; 分子對(duì)接

中圖分類號(hào)： R 915 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? ?文章編號(hào)： 1000-5137（2020）04-0398-07

Abstract： The interaction between Amprenavir and human serum albumin （HSA） was studied by spectrophotometry combined with molecular docking technology under the conditions of simulating human body environment in vitro.The results of fluorescence spectrometry showed that Amprenavir enhanced the fluorescence intensity of HSA.And the calculation of binding constants and thermodynamic constants proved the existence of hydrophobic forces and electrostatic forces.UV-Vis spectra indicated that the absorption intensity of Amprenavir-HSA was gradually increased，which suggests that there was interaction between Amprenavir and HSA.The change of Stokes shift was observed from 62 nm to 86 nm through three-dimensional spectra，which indicated that Amprenavir increased the polarity and decreased the hydrophobicity of HSAs microenvironment.Circular dichroism was used to calculate the content of α-helix structure of HSA as well.Results showed that α-helix structure increased from 18.38% to 63.62% after the addition of Amprenavir.It proved that the interaction between Amprenavir and HSA changed the secondary structure of the protein.The result of molecular docking study suggested that the interaction between Amprenavir and HSA mainly occurred at ⅡA domain of HSA.This was further confirmed by the analysis of synchronous fluorescence spectrometry.This research provided a theoretical reference for further studies of Amprenavir in vivo.

Key words： human serum albumin （HSA）; Amprenavir; interaction; spectrometry; molecular docking

0 ?引 ?言

人類免疫缺陷病毒（HIV）是一種以核糖核酸（RNA）為遺傳物質(zhì)的艾滋病病毒，根據(jù)血清的分型，可將HIV分為Ⅰ型（HIV-1）和Ⅱ型（HIV-2）兩種類型.艾滋病又名獲得性免疫缺陷綜合癥，其感染性強(qiáng)、潛伏期長，是一種危害極大的傳染病.安普那韋具有一定的抗HIV-1和HIV-2蛋白酶的作用，通過阻斷HIV成熟所必需的蛋白質(zhì)前體的分裂，來干擾病毒的生長過程，然后釋放出沒有成熟的、不具有傳染性的HIV病毒分子.如果長期地服用安普那韋，可以降低血液中的HIV的負(fù)荷，降低感染艾滋病的機(jī)率，對(duì)于延長生命，提高生活質(zhì)量有一定的輔助作用[1-2].

人血清白蛋白（HSA）是人體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，具有特殊的配體結(jié)合能力，能與外源、內(nèi)源物質(zhì)相結(jié)合，對(duì)于藥物分子轉(zhuǎn)運(yùn)到被吸收部位以發(fā)揮效力有重要作用[3-5].近年來，有很多學(xué)者對(duì)HSA和小分子藥物的相互作用進(jìn)行了研究.孫曉悅等[6]利用光譜法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：呋喃西林可以靜態(tài)猝滅HSA的固有熒光，且兩者的相互作用位點(diǎn)在HSA的ⅢA亞結(jié)構(gòu)域.PRAGNA等[7]利用熒光光譜法、紅外光譜法、圓二色譜法等研究了2，4-二乙?；g苯三酚動(dòng)態(tài)猝滅HSA的固有熒光，改變HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu).研究HSA和藥物分子的相互作用對(duì)于了解藥物在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布、代謝以及作用機(jī)制等藥代動(dòng)力學(xué)具有一定的參考價(jià)值[8].

目前，已有很多學(xué)者對(duì)于安普那韋的合成進(jìn)行了相應(yīng)的研究，但是尚未有人對(duì)安普那韋和HSA在人體內(nèi)外的相互作用機(jī)制進(jìn)行研究.對(duì)于藥物分子而言，它們?cè)隗w內(nèi)的分布與代謝主要取決于他們是否能和人體中主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HSA結(jié)合.目前為止，安普那韋與HSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和作用位點(diǎn)尚未明確.本研究通過熒光光譜法，檢測(cè)安普那韋與HSA的相互結(jié)合，經(jīng)計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等有關(guān)兩者相互作用的參數(shù);利用紫外-可見光譜法及圓二色譜法，研究了兩者之間的相互作用對(duì)HSA結(jié)構(gòu)的影響;還通過分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)了安普那韋與HSA之間的相互作用位點(diǎn)，并且結(jié)合同步熒光光譜法對(duì)分子對(duì)接預(yù)測(cè)的位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證，對(duì)于研究安普那韋在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布、代謝，和對(duì)人體的作用機(jī)制以及艾滋病的治療具有一定的參考作用.

1 ?材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國Varian公司）;TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）;J-815型圓二色譜儀（JASCO公司）;HSA（純度大于98.0%），上海源葉;安普那韋（純度大于98.0%），上海源葉;所用其他試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制HSA貯備液（1.0×10-4 mol?L-1）;用乙醇配制安普那韋貯備液（1.0×10-3 mol?L-1），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?在300～500 nm波段內(nèi)掃描熒光光譜圖，設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫為5 nm;從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）獲得HSA的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1H9Z），采用Autodock 2.5軟件進(jìn)行分子對(duì)接.

2 ?結(jié)果與討論

2.1 安普那韋與HSA的熒光光譜

HSA的熒光主要來自色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），但是由于Phe含量比較低，Tyr的熒光在被離子化時(shí)幾乎被猝滅，因此HSA的固有熒光主要來自位于ⅡA疏水亞域的Trp 214殘基.當(dāng)藥物與HSA發(fā)生相互作用時(shí)，Trp的環(huán)境的改變導(dǎo)致HSA的熒光強(qiáng)度有所改變[9].

根據(jù)表1所示，安普那韋與HSA的結(jié)合常數(shù)K比較大，說明兩者之間通過結(jié)合發(fā)生了相互作用;ΔG<0說明安普那韋與HSA的反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行;ΔS>0，ΔH<0說明兩者之間的作用力主要是疏水和靜電作用力[10].

2.2 安普那韋與HSA的紫外-可見光譜

在紫外-可見吸收光譜中，由于電子躍遷，HSA會(huì)有兩個(gè)特征的吸收帶.如圖2所示，隨著安普那韋的增加，HSA的兩個(gè)特征吸收峰的吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明HSA與安普那韋發(fā)生了相互作用.

2.3 安普那韋與HSA的三維熒光光譜

圖3（a）是HSA的三維熒光光譜圖，圖3（b）為安普那韋加入后HSA的三維熒光光譜圖.由圖3可知：隨著安普那韋的加入，HSA的兩個(gè)峰的強(qiáng)度都有所增加，具體的峰值變化如表2所示.其中λex為激發(fā)波長，λem為發(fā)射波長，F(xiàn)為熒光強(qiáng)度.

由表2可知：在加入安普那韋之后，峰1和峰2的強(qiáng)度都有所增加，其中峰2的熒光強(qiáng)度增加較為明顯;峰2的斯托克斯位移從62 nm增加到86 nm，表明安普那韋的加入可使HSA的氨基酸的微環(huán)境極性增加，疏水性減弱[11].

2.4 安普那韋與HSA的圓二色譜

在圓二色光譜（CD）圖中，由于電子躍遷，HSA會(huì)在208 nm和222 nm處出現(xiàn)的兩個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[12-14]，如圖4所示.安普那韋加入后使HSA在208 nm及220 nm處的負(fù)槽減小，通過計(jì)算得出：當(dāng)HSA與安普那韋之間的摩爾比為1∶0，1∶5和1∶10時(shí)，HSA中的α-螺旋結(jié)構(gòu)在HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)元件數(shù)量的占比分別為18.38%，50.94%和63.62%，表明安普那韋與HSA的相互作用使HSA中的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，改變了HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu).

2.5 安普那韋與HSA體系的分子對(duì)接

分子對(duì)接是一種預(yù)測(cè)藥物結(jié)構(gòu)的主要工具[15]，本文作者利用分子模擬技術(shù)來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)和藥物之間的作用位點(diǎn)和結(jié)合區(qū)域.Lys199和Arg222位于HSA的IIA結(jié)構(gòu)域[16].如圖5所示，分子對(duì)接結(jié)果得到安普那韋與HSA的相互作用主要發(fā)生在Lys199和Arg222之間，可以預(yù)測(cè)安普那韋與HSA的相互作用主要發(fā)生在的ⅡA區(qū)域.

2.6 安普那韋與HSA的同步熒光光譜

圖6中，當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，酪氨酸熒光強(qiáng)度隨安普那韋濃度的增加而降低;而當(dāng)?λ=60 nm時(shí)，色氨酸的熒光強(qiáng)度隨安普那韋濃度的增加而升高.在兩者的同步光譜圖中，色氨酸的同步熒光光譜與圖1的熒光光譜的趨勢(shì)相符，說明了安普那韋與HSA的相互作用主要發(fā)生在色氨酸附近[17].同時(shí)也表明了兩者作用位點(diǎn)主要位于ⅡA區(qū)域，與分子對(duì)接的預(yù)測(cè)相符.

3 ?結(jié) ?論

本文作者通過光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)，研究了安普那韋與HSA之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、相互作用力以及相互作用位點(diǎn)等，為安普那韋在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布和代謝提供了一定的參考依據(jù).熒光光譜表明安普那韋可以增加HSA的熒光強(qiáng)度;在298 K條件下的反應(yīng)結(jié)合常數(shù)為2.44×107 L?mol-1，表明了安普那韋與HSA之間結(jié)合較為緊密;熱力學(xué)參數(shù)說明兩者之間的作用力主要是疏水和靜電作用力.紫外-可見光譜顯示安普那韋與HSA發(fā)生相互作用.三維熒光光譜的斯托克斯位移在加入安普那韋前后由62 nm增加到86 nm，說明安普那韋可以使HSA的極性增加，疏水性減弱.圓二色譜計(jì)算得到HSA的α螺旋從18.38%增加到63.62%，表明了安普那韋可以改變HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使HSA的構(gòu)象發(fā)生變化.用分子模擬技術(shù)預(yù)測(cè)了HSA與安普那韋之間的相互作用的位點(diǎn)主要位于HSA的ⅡA區(qū)域，并且通過同步熒光光譜證明了分子對(duì)接的預(yù)測(cè)，說明了安普那韋與HSA之間的相互作用位點(diǎn)主要位于HSA的ⅡA區(qū)域.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）