甜味劑的甜度測量方法研究進展

姚宇晨，楊 釗,，梁幼飛，韋 玲，王 寶,3，徐光輝,3，張家智*

(1中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京102209；2中糧屯河崇左糖業(yè)有限公司，廣西崇左532200；3中糧屯河糖業(yè)股份有限公司，農(nóng)業(yè)部糖料與番茄質量安全控制重點實驗室，國家糖料加工技術研發(fā)專業(yè)中心，新疆昌吉831100)

0 引言

甜味劑常應用于食品飲料加工與開發(fā)領域，在食品工業(yè)發(fā)展中占據(jù)重要位置[1]。廣義的甜味劑指含蔗糖、乳糖等食物原料在內，所有賦予食品以甜味的食品添加劑。狹義上的甜味劑僅指“代糖”甜味劑，不包含蔗糖等基礎甜味物質，目前世界上允許使用的“代糖”甜味劑有20余種，我國現(xiàn)行《食品添加劑使用標準》(GB2760-2014)中規(guī)定可用于食品加工的甜味劑包括三氯蔗糖、甜蜜素、赤蘚糖醇、甜菊糖苷等共計20種，其種類還將持續(xù)增加。

甜味是甜味劑的重要性質，可以增強食物的風味以及影響我們對食物種類的偏好。甜味的強弱用甜度來表示，甜度的衡量通常以一定濃度的蔗糖水溶液在20℃時的甜度為1.0作為基準，其他物質的甜度則與之相比而得到。在日常生活中，人們通常用感官，也就是舌頭來品評甜度[2]。在科學研究中，主要是用各種化學試劑、分析儀器等來檢測樣品的甜度，然后根據(jù)單個甜味物質的含量及單個甜味物質的甜度來測定食物或復雜化合物的甜度。然而儀器只能檢測食品中有甜味可溶性固形物的含量，并非真實的樣品甜度，因此，如何在主觀因素影響盡可能小的條件下將生理水平的甜度客觀定量分析成為目前的研究重點。

本文在簡要介紹甜味物質的基礎上，對廣義上的甜味劑甜度測量方法進行了歸納分析，并對其發(fā)展前景進行了一定展望，以期為測量方法的進一步發(fā)展提供參考，并為甜味劑在終端食品中的應用提供可行性措施。

1 甜味物質來源及分類

天然甜味物質主要為糖類，屬多羥基醛或多羥基酮及其衍生物，含有天然甜味的物質可提供身體所需的能量。影響糖類物質甜度的主要因素有糖的聚合度、濃度、溶解速度和溫度等，其中聚合度越高，則糖的甜度越低，這是僅少數(shù)單糖、低聚糖有甜味的原因。自然界中具有甜味的單糖主要為葡萄糖、果糖和半乳糖，低聚糖主要包括蔗糖、乳糖、麥芽糖等，其中蔗糖的甜味最為純正，因此作為檢測其他甜味物質甜度的參照。

廣義的甜味劑按來源可分為天然甜味劑和人工甜味劑，其中蔗糖、葡萄糖、乳糖等日常食用物品屬于食品原料范圍，參與人體新陳代謝，被稱為天然營養(yǎng)型甜味劑[3]。天然非營養(yǎng)型甜味劑通常具有低熱量特點，按其甜度可分為低甜度的麥芽糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇等，以及高甜度的羅漢果苷、甜菊糖苷等。人工甜味劑具有高甜度、低熱量且在人體內不進行代謝吸收的特點，通過化學方法修飾天然甜味劑或純粹經(jīng)化學合成獲得，因其甜度是蔗糖的幾百倍至幾千倍，所以用量極低，又被稱為非營養(yǎng)型甜味劑[4]，按其種類可分為蔗糖衍生物類(三氯蔗糖等)、磺胺類(糖精鈉、甜蜜素等)和二肽類(阿斯巴甜、紐甜等)，其中三氯蔗糖被認為是蔗糖最理想的替代品，其甜度約為蔗糖的600倍，同時具有相對較好安全性和穩(wěn)定性[5]。

2 測量方法

甜度用來表征化合物或食物的甜味強弱。目前，甜味劑的甜度測量方法主要分為分析化學檢測法、生物學檢測法和細胞水平檢測法3種。

2.1 分析化學檢測法

分析化學檢測法主要利用化學手段檢測待測物質中甜味化合物的含量，包含分光光度計法、甜度計法、色譜檢測法、近紅外光譜檢測法和電子舌法等，此類方法能精確檢測到甜味物質的含量，但很難準確定量生理水平上的甜度。

2.1.1 分光光度計法

分光光度計法是較早用于食品中甜度檢測的方法，主要包括傳統(tǒng)的比色法、可見光分光光度計法和紫外分光光度計法，原理是將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液，得到與不同波長相對應的吸收強度，差別在于不同的樣品處理方法得到的有色物質溶液顏色種類和深度均不同。Fábio R.P等[6]嘗試將甜蜜素轉化為環(huán)己胺后與 1,2-萘醌-4-磺酸鈉反應，于 480 nm處測定衍生物，檢出限達7.7×10-6mol/L。王守蘭等[7]利用糖精鈉可與氯化鈉、磷酸等反應生成強熒光配合物，得到測量飲料中糖精鈉的熒光分光光度法。王秀玲等[8]優(yōu)化出甜蜜素的紫外分光光度計檢測法，該法標線在0.015～0.75 g/kg甜蜜素范圍內符合比爾定律。比色法的優(yōu)點在于前處理相對簡單，操作簡便，缺點是有顏色的物質容易形成干擾且樣品處理后不可長時間放置，進而對測量結果的準確性造成影響。

隨著甜味劑種類的不斷增多，對檢測水平的要求也不斷提高，傳統(tǒng)的分光光度計法已不能滿足需求，為同時測定2種或以上的甜味劑，有研究者在該方法中引入人工神經(jīng)網(wǎng)絡，當多組分的吸光度加和性較差時，人工神經(jīng)網(wǎng)絡能夠提供優(yōu)良的光譜校正作用，如馮江等[9]采用反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡紫外分光光度法同時測定了飲料中糖精鈉、苯甲酸等組分，給新型多源綜合檢測方法開辟了道路。

2.1.2 甜度計法

甜度計法是通過測量水溶液的折光率來反應糖的濃度，較為典型的有光導糖度計、智能化激光旋光糖度計等。其檢測原理是可溶性固形物含量與折光率在一定條件下成正比，溶液濃度增加，光的折射率以一定比例增大，故可根據(jù)糖水溶液的折光率計算溶液中的含糖量。目前，甜度計法使用較多的是阿貝折光儀，具有測量精度高、分辨率好且樣品用量低等優(yōu)點，尤其可在較大的溫度范圍內使用，目前已廣泛用于醬油、番茄醬等產(chǎn)品以及糖稀、糖液等含糖量高的甜度檢測[10]。然而，現(xiàn)有的甜度計多需長期嚴格保養(yǎng)以保證儀器精密度，同時其仍不能在接近生理的條件下進行甜味物質的甜度檢測。

2.1.3 色譜檢測法

色譜檢測法近年來發(fā)展迅速，有多種方法可以用來分析甜味劑的含量，包括薄層色譜法(Thin-layer Chromatograph，TLC)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、離子色譜法(Ion Chromatography，IC)、氣相色譜法(Gas Chromatography， GC)和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer，LC-MS)等[11]。不同類型色譜檢測法的比較見表1。

表1 不同類型色譜檢測法的比較

由于不同甜味劑的理化性質、光譜性質和電化學性質存在較大差異，對應色譜檢測方法的適用范圍也不同?？傮w上講，TLC法主要根據(jù)待檢物質在薄層上的比移值和顯色斑深淺進行定性和半定量，僅適用于快速分離和定性分析少量甜味物質，有很大局限性[12]。IC方法樣品分析速度快、選擇性強，適合大量樣品的檢測，其中的離子排斥色譜針對性應用于糖類的分離，例如，糖精在酸性條件下以陰離子形式存在，可以利用陰離子交換的離子色譜進行分離，化學抑制電導檢測[13-14]。HPLC法在結果的重復性及客觀性上具有優(yōu)勢，常用 UV[15]、ELSD[16]、DAD[17-18]、RID[19]等檢測器，但測定過程耗時且需要復雜的前處理，若甜度測量精度要求高，可作為生理水平檢測結果的有利輔助或補充，很多學者在基礎方法上又進行了優(yōu)化，例如，周文清等[20]建立一種用于測定運動飲料中甜菊糖苷的HPLC-PDA檢測方法；楊小琪等[21]曾建立了4種甜味劑甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、糖精鈉的離子對反相高效液相色譜測定方法，該方法快速簡便、不需衍生；蘇建國等[22]建立超高效液相色譜法(UPLC)可同時測定風味飲料中安賽蜜、糖精鈉等4種食品添加劑的含量，白麗真等[23]又升級了該方法，可同時測定白酒中7種甜味劑的含量。GC法的前處理過程較繁瑣，在部分已知甜味劑的檢測中有重要應用，如 GC-FID已廣泛應用于各種食品和飲料中甜蜜素的檢測[24-26]，GC配以電子捕獲檢測器(ECD)減少了基質中雜質的干擾，也可用于甜蜜素的檢測[27]。

此外，隨著質譜(Mass Spectrometer，MS)的普及，各種新型質譜的應用豐富了色譜法的內容，色譜-串聯(lián)質譜法綜合色譜的分離能力和質譜的定性功能，具有更高的靈敏度和選擇性，避免雜質偽峰的干擾，定性優(yōu)勢逐漸凸顯，常涉及復雜混合物的定性，用于多種糖分或人工甜味劑的含量檢測[28]。氣質聯(lián)用法曾用于監(jiān)測三氯蔗糖的合成過程[29]，馬紅等[30]超聲提取食品中的甜蜜素與亞硝酸鈉反應，衍生物通過氣相色譜質譜聯(lián)用法進行分離檢測，檢出限為1.5 mg/kg，甜蜜素的假陽性結果顯著減少。電噴霧質譜(ESI-MS)和飛行時間質譜(TOF-MS)也應用于多組分甜味物質的檢測中[31-32]。

2.1.4 近紅外光譜法

近紅外光譜分析技術(Near Infrared Spectrum，NIR)是一種快速、無損的分析檢測技術，由于采用光纖技術在線分析測量的過程中無需有機溶劑，因而被稱為“綠色”的分析方法，近年來被廣泛應用于食品和農(nóng)產(chǎn)品的檢測中。

近紅外光譜分析技術相較其他化學分析法，優(yōu)點在于樣品預處理簡單，可直接測定固體、半固體、液體、膠體等樣品，近紅外光譜圖提供的信息量大可對多種成分同時進行分析，分析速度快，一般樣品可在1 min內完成且成本低；但劣勢也十分明顯，由于近紅外區(qū)譜帶重疊多，需依賴于復雜的校正體系、標準測量方法以及大量的訓練集樣本。在實際應用中，唐志國等[33]采用主成分分析與神經(jīng)網(wǎng)絡相結合的方法建立新的近紅外光譜模型，對果凍中甜蜜素含量進行了定量分析；范方媛等[34]利用NIRS-PLS法對滋味特征總分、甘甜度、醇爽度及陳化度分別建模，實現(xiàn)白茶感官滋味特征屬性的快速預測評價。另外，NIR與高效液相色譜(HPLC)和核磁共振(HNMR)結合使用可用于對人工合成甜味劑、復合甜味劑的表征分析，如紐甜[35]、三氯蔗糖[36]、雙甜[37]等，可對其甜度等性能做出評估。

2.1.5 電子舌法

電子舌(E-tongue)技術是一種可以檢測出可溶性物質味道的新型檢測技術，它模仿動物舌頭功能，使用一種類似于生物系統(tǒng)的敏感膜作為傳感器，當其受到味覺物質刺激，傳感器會與食品中糖的成分進行氧化還原反應，類脂薄膜一側的膜電位變化，發(fā)出信號跟人的感覺信號建立對應關系，最后得出人的甜味感覺，從而對甜度進行量化分析，原理如下圖1所示。目前，常見的傳感器類型有電位型、伏安型和阻抗譜型等[38]，不同傳感器的具體特點如表 2。從技術上講，電子舌技術具有簡化試驗操作過程的優(yōu)點，不需要對樣品進行預處理便可直接無損檢測，且靈敏度高、檢測速度快、重復性和可現(xiàn)性好，同時由于是對液體樣本的味覺特征進行總體評價，電子舌技術還可有效避免人的感官差異和主觀偏好行為[39]。相較于人的舌頭，電子舌對甜味的檢測低限可達1×10-6mol/L蔗糖濃度，遠低于人舌10-2mol/L蔗糖濃度的檢測低限。此外，電子舌不僅可以有效識別甜味，還可區(qū)分辨識其余4種基本滋味，針對目前部分天然甜味劑存在的后苦味、酸澀味等影響甜味的異味識別問題上，具有極高的研究應用價值[40-41]。

圖1 電子舌和人的舌頭的味覺感知工作原理

表2 基于不同傳感器類型的電子舌特點比較

目前，電子舌已應用于多種類食品的滋味檢測，包括飲料、酒類、烘焙糕點等，常與化學計量學等方法結合使用，既可以對單純甜味劑做甜度檢測，也可對甜味劑作為某一組分的混合成分食品進行分析。例如，楊陽等[42]發(fā)現(xiàn)利用電子舌技術和主成分分析評價甜菊糖的甜味特性，與感官評價結果一致，表明電子舌可以較好的代替人工感官進行甜味評價；姚月鳳等[43]采用電子舌分析結合多元統(tǒng)計分析手段綜合評價茶湯滋味，并建立甜純滋味特征判別方程，為茶湯滋味的客觀、智能評價提供依據(jù)；王鵬等[44]以功能飲料為載體，采用主成分、聚類及Person相關系數(shù)分析，探究得到電子舌與人工感官評價結果間差異不顯著，具有一致性。綜上所述，在智能嗅覺系統(tǒng)發(fā)展日趨成熟的形勢下，電子舌技術一定程度上解決了食品快速現(xiàn)場評價手段對食品工業(yè)化的制約，作為一種現(xiàn)代化分析檢測方法，是當前甜味的滋味評價領域發(fā)展前景較好的一種綜合分析檢測方法。

2.2 生物學檢測法

生物學檢測法主要采用人工測評法，甜味物質的甜度通過專業(yè)的評價員進行比較測定出來，通常以人為規(guī)定蔗糖甜味倍數(shù)為1作為比較標準。人舌頭上的味蕾細胞對2%以下的甜度最為敏感，可以在大約1%的蔗糖溶液中識別甜味，蔗糖濃度達到15%時可識別糖漿。因此，一般使用1%～15%范圍內不同甜度評級的蔗糖溶液培訓評價員，并在刻度線上定量甜度，品嘗已知濃度的標準蔗糖溶液和一系列被測甜味劑稀釋液，當被測物甜味與標準蔗糖溶液甜味一致時，此時的標準蔗糖溶液濃度除以被測物濃度的數(shù)值即為被測物的甜味倍數(shù)。

甜度感官評價常用的具體方法包括差別檢驗、描述性分析和標度和類別檢驗等，它的優(yōu)點在于可以在最接近生理條件的檢測體系上定量甜度，但劣勢十分明顯，實驗耗時時間長且成本高，外部因素包括溫度、溶劑、其他刺激等均會影響人的甜味感受，因此，評價環(huán)境嚴格受限。據(jù)報道，人體在40℃時對甜味最敏感，若低于或高于這個溫度，甜味閾值將下降[45]，且溶液的 pH值、滲透壓、可溶鹽等因素也會改變人體對甜味的感知。若要保證感官評價在已知和最小干擾的可控條件下進行，需在極專業(yè)的評價環(huán)境，即符合CNAS-GL014-2018《感官檢驗領域室認可技術指南》要求的實驗室開展實驗。此外，該評價過程完全依賴于評價員的感官和經(jīng)驗，而評價員由于個體、生活環(huán)境和閱歷等生理和心理的差異，對甜度客觀、真實感受的表達存在很大的制約性，例如，長期在制糖廠工作的人員對甜味更加敏感，與專業(yè)科研實驗室人員對同一砂糖的甜度感知很可能出現(xiàn)差異。雖然摻雜人為主觀因素使得評價結果不夠科學嚴謹，無法精確定量甜度，但目前還未出現(xiàn)可完全替代感官評價的檢測方法，其仍為評價甜味劑感官屬性最有效的方法[46]。

我們在研究中發(fā)現(xiàn)，甜味劑的甜味的細微差別也能影響下游產(chǎn)品的風味，即使是應用最廣泛的傳統(tǒng)白砂糖。例如，使用不同廠家的精制白砂糖生產(chǎn)出的QQ軟糖產(chǎn)品在酸甜度和整體口感上存在明顯差異，經(jīng)驗證是白砂糖的甜味強度隨時間變化的細微不同，影響了其在 QQ軟糖產(chǎn)品中應用效果。直接評價白砂糖的甜味強度隨時間的細微變化的難度較大，而將白砂糖做成 QQ軟糖產(chǎn)品后再進行甜味和風味評價，更易發(fā)現(xiàn)白砂糖甜度之間的差別。

2.3 細胞水平檢測法

細胞水平檢測法是一種新型綜合甜味成分檢測和生理特性評價的檢測方法，由于對實驗要求較高，目前應用范圍較小。人類能感知甜味主要源于甜味化合物和受體的多點結合，口腔中味覺上皮組織常存在甜味受體的2種蛋白亞基T1R2和T1R3表達，而甜味受體和甜味分子之間作用位點的數(shù)量和相互結合的有效程度決定甜味的強弱。研究表明，甜味受體可以對部分天然甜味物質和人工合成甜味劑產(chǎn)生應答，激活后的甜味受體可以通過GPCR-Gs-cNMP途徑和 GPCR-Gα/Gβγ-IP3途徑來調節(jié)胞內Ca2+濃度，進而改變細胞膜電位，釋放神經(jīng)遞質傳遞信息[47]。

在細胞水平上模擬人源甜味受體對甜味物質的感知程度進而定量檢測甜度方面，培養(yǎng)可以穩(wěn)定表達T1R2/T1R3受體蛋白的細胞株，通過檢測胞內熒光強度計算 Ca2+濃度，是典型的細胞株法測定甜度[48-49]。Fujiwara等[50]以蔗糖為參比，分析了5種甜味劑的細胞反應，通過檢測胞內Ca2+濃度可以明顯區(qū)分不同甜味劑的甜味強度和代糖的靈敏度。但在細胞水平上建立一個標準定量檢測未知樣品的甜度，單純的胞內Ca2+濃度變化并不能完全做到，于是細胞模型的建立與甜味劑刺激的胞內Ca2+濃度增量值逐漸引起注意，查麗玲等[51]探究基于甜味感應細胞鈣影像的甜度檢測方法，利用鈣影像進一步建立甜味感應細胞模型NCI-H716細胞，通過qPCR、Western blot等技術觀察甜味受體 T1R2/T1R3在mRNA和蛋白水平的表達情況，尋找人工甜味劑甜度和甜味受體表達量間的相關性；另外甜味感應細胞模型本身也存在差異，通過HEK-293細胞構建穩(wěn)定共表達重組人源甜味受體蛋白的真核細胞系，蛋白受體的表達量則更易于控制[47]，目前已經(jīng)用于構建細胞模型的細胞，還有人的腸道內分泌細胞HuTu-80、胰島 β-細胞等[52]。細胞水平檢測法在甜味劑的使用安全性及甜味感知機理上提供了新的思路與生物學基礎，不斷尋找對甜味感應更強的細胞株將使該方法的應用范圍更加廣泛。

3 展望

由于消費者希望在保持甜味感覺的同時實現(xiàn)營養(yǎng)健康、低熱量的訴求，從第1代糖精開始，甜味劑經(jīng)歷了甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖等更新?lián)Q代，逐漸走向低熱量、高甜度又兼具功能性的發(fā)展方向。隨著安全性更高、使用性能更好的甜昧劑的市場應用規(guī)模不斷擴大，甜度的測量方法也需更加科學、細致、合理。

甜味劑種類不斷的增多使樣本基體傾向多樣化，更有效的樣本前處理方式和待測成分的提取富集方法或成為未來甜度檢測方法的研究重點，同時具有仿生意義的甜味覺傳感器實驗系統(tǒng)將綜合化學和生理水平的定量需求成為新型測量方法的發(fā)展方向，它不僅從真實客觀的角度反映甜度，也可以做到綜合評價甜味整體的感受質量，包含甜味相關的多種感官屬性評價，這對甜味劑應用品質的提升和調控具有十分積極的意義。另外，甜度和風味的評價可以直接對甜味劑本身進行，也可以將甜味劑應用到下游產(chǎn)品中后，通過評價下游產(chǎn)品的甜度和風味來間接評價甜味劑，尤其對于細微差別的評價，此種方法更為可靠和有效。

雖然甜味劑市場逐步興起，意味著蔗糖替代品的數(shù)量增加，但甜味劑自身仍存在一定局限性，超標準范圍使用、超限量添加、標識不合規(guī)、濫用復配、質量不合格等問題時有出現(xiàn)[53]，且長期食用后其對人體的健康影響有待進一步研究明確。由于全球城市居民減少熱量攝入的趨勢 ，甜味劑的發(fā)展將代替部分食糖 ，但代替不了蔗糖的營養(yǎng)功能 ，研究甜味劑科學的甜度測定 ,有助于防止盲目跟風替代，促進協(xié)調發(fā)展。