siRNA干擾lncRNA ANRIL表達(dá)對經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞的影響及作用機(jī)制

陳 君 姜淑賢

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種以黏膜炎性反應(yīng)為主要病理特征的慢性非特異性結(jié)腸炎性疾病[1]。近年來調(diào)查結(jié)果顯示，中國的UC發(fā)病率呈上升趨勢，且患者以青壯年為主[2-4]。UC嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，也給社會(huì)造成沉重的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。UC患者長鏈非編碼INK4基因座的反義RNA(lncRNA ANRIL)表達(dá)明顯增多，是UC患者可能的生物學(xué)標(biāo)志物[6]。UC患者炎性因子Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)量明顯增多[7]。推測lncRNA ANRIL可能通過在UC中調(diào)控TLR4發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC為研究模型，通過觀察lncRNA ANRIL對FHC細(xì)胞凋亡及對炎性因子TLR4的影響，探討其在UC中的具體作用，以期為UC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)

首先配制細(xì)胞培養(yǎng)液，在DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中加入2.5%胎牛血清。將胎兒結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC(上海冠異生物公司)在37 ℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，5～6 d傳代1次。將FHC細(xì)胞隨機(jī)分為4組：空白組、模型組、對照組和siRNA-ANRIL組。空白組不予處理，模型組、對照組和siRNA-ANRIL組用8 μg/mL LPS 24 h誘導(dǎo)FHC細(xì)胞模擬UC樣改變，檢測細(xì)胞活力和炎性因子水平來判斷UC細(xì)胞模型是否造模成功[8]。當(dāng)FHC細(xì)胞匯合度大約達(dá)到50%時(shí)，對照組和siRNA-ANRIL組分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC及siRNA-ANRIL[9]，經(jīng)過6 h后，將培養(yǎng)液換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

將FHC細(xì)胞接種于96孔板中，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，舍棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，舍棄上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，通過震蕩使紫色結(jié)晶物充分溶解，使用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific MultiSkan Go)于560 nm波長處測吸光度(OD)值[10]。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

首先將FHC細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后，用無乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1 000 g離心3 min后，吸出上清液。再加入1 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，離心，吸出上清液。加入195 μL結(jié)合液，重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，最后加入10 μL PI染液輕輕混勻，室溫避光孵育15 min[11]。

1.4 熒光定量PCR檢測ANRIL mRNA、TLR4 mRNA含量

將FHC細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑(日本TaKaRa公司)提取細(xì)胞中的總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)對樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件是：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)50個(gè)循環(huán)反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量[11]。引物由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)

將FHC細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，低溫離心，取上清液采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠，上樣后，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。在4 ℃條件下兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1∶500，美國Abcam公司)，過夜。在室溫條件下孵育山羊抗兔二抗(1︰3 000，美國Proteintech公司)。使用ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)成像，并用Image J進(jìn)行半定量分析[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較

空白組、模型組、對照組和siRNA-ANRIL組OD值分別為0.82±0.07、0.59±0.08、0.62±0.05和0.74±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組OD值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，對照組OD值無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，siRNA-ANRIL組OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明干擾lncRNA ANRIL表達(dá)可增強(qiáng)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的FHC細(xì)胞的活力。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

空白組、模型組、對照組和siRNA-ANRIL組細(xì)胞凋亡率分別為0、(42.7±3.6)%、(46.2±4.2)%和(6.3±0.4)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，對照組細(xì)胞凋亡率無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，siRNA-ANRIL組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。上述結(jié)果表明干擾lncRNA ANRIL表達(dá)可降低經(jīng)LPS誘導(dǎo)的FHC細(xì)胞的凋亡率。

圖1 各組細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-PI染色 A 空白組 B 模型組 C 對照組 D siRNA-ANRIL組

2.3 各組ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平比較

與空白組比較，模型組ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，對照組ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，siRNA-ANRIL組ANRIL mRNA、TLR4 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明干擾lncRNA ANRIL表達(dá)可降低經(jīng)LPS誘導(dǎo)的FHC TLR4 mRNA水平。見表2。

表2 各組ANRIL mRNA、TLR4 mRNA Ct值比較

2.4 各組TLR4蛋白表達(dá)水平比較

空白組、模型組、對照組和siRNA-ANRIL組TLR4蛋白表達(dá)水平見圖2。經(jīng)Image J半定量分析，結(jié)果分別為0.26±0.05、0.98±0.06、0.89±0.12和0.36±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組TLR4蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，對照組TLR4蛋白表達(dá)水平無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，siRNA-ANRIL組TLR4蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明干擾lncRNA ANRIL表達(dá)可降低經(jīng)LPS誘導(dǎo)的FHC TLR4 蛋白表達(dá)水平。

圖2 各組TLR4蛋白的電泳圖

3 討論

UC發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其是環(huán)境、免疫和遺傳共同作用的結(jié)果。近年來，UC的發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重影響人們的健康安全。隨著病程的進(jìn)展，UC患者可能發(fā)生并發(fā)癥，如中毒性巨結(jié)腸、結(jié)腸出血等，若不及時(shí)干預(yù)可能導(dǎo)致死亡。研究UC發(fā)病機(jī)制對于臨床治療具有積極的指導(dǎo)意義。

利用LPS誘導(dǎo)FHC細(xì)胞發(fā)生炎性損傷來構(gòu)建體外UC模型，出現(xiàn)細(xì)胞活力顯著減弱，炎性因子水平顯著提高，即為體外UC細(xì)胞模型構(gòu)建成功；siRNA-ANRIL組ANRIL mRNA表達(dá)水平低于對照組，表明siRNA干擾lncRNA ANRIL表達(dá)成功。本研究結(jié)果顯示siRNA-ANRIL組細(xì)胞OD值高于對照組，而細(xì)胞凋亡率低于對照組，表明干擾lncRNA ANRIL表達(dá)可有效抑制LPS對FHC細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率。

TLR4是TLR家族中較早被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)成員，作為介導(dǎo)炎性反應(yīng)的主體，普遍分布于多種免疫細(xì)胞的膜表面，具有識別炎性反應(yīng)、應(yīng)激、機(jī)體損傷等相關(guān)內(nèi)源性配體的作用[13-14]。目前，已有許多研究證實(shí)TLR4參與了UC的發(fā)病及進(jìn)展過程[15-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-ANRIL組TLR4 mRNA和TLR4表達(dá)水平均低于對照組，表明干擾lncRNA ANRIL表達(dá)可降低LPS誘導(dǎo)的FHC細(xì)胞TLR4表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)作用。LncRNA ANRIL 的作用機(jī)制主要有兩個(gè)方面：一方面 LncRNA ANRIL可與多梳抑制復(fù)合物的核心亞基EZH2 相互作用，介導(dǎo)組蛋白 H3K27 的三甲基化，沉默基因轉(zhuǎn)錄；另一方面LncRNA ANRIL也可與多梳抑制復(fù)合物相互作用，催化 H3K27 三甲基化，沉默靶基因表達(dá)[18]。LncRNA ANRIL是否可通過與多梳抑制復(fù)合物相互作用來抑制TLR4，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，siRNA干擾LncRNA ANRIL表達(dá)可增強(qiáng)FHC細(xì)胞活力，降低凋亡率，并抑制炎性因子TLR4表達(dá)，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，提示LncRNA ANRIL可作為一類新型的具有生物學(xué)功能的臨床標(biāo)志物，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，對UC的發(fā)生、發(fā)展及治療有重要作用。本實(shí)驗(yàn)有助于進(jìn)一步認(rèn)識LncRNA ANRIL在UC中的作用，有望為UC的治療提供新的靶點(diǎn)，對后續(xù)的科研有進(jìn)一步的指導(dǎo)意義。