miR-301a-3p在胰腺癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系的研究

范金斌 胡成俠

胰腺癌在常見的惡性腫瘤中侵襲性較高、預(yù)后較差，手術(shù)切除是治療胰腺癌的有效方法，但由于缺乏有效的早期診斷方法，導(dǎo)致患者的生存率較低[1]。目前影像學(xué)技術(shù)和血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)胰腺癌診斷的敏感度和特異度均有待進(jìn)一步提高[2-3]。因此，為了改善胰腺癌患者的預(yù)后，迫切需要尋找特異度更高、侵襲性更小的診斷標(biāo)志物。微RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上可作為蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子[4]，有望成為疾病新的診斷及預(yù)后判斷標(biāo)志物。miR-301a-3p在多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)[5-6]，但目前其在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道較少。本研究探討了miR-301a-3p在胰腺癌中的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為胰腺癌的早期干預(yù)提供更多依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年1月至2019年1月宿遷市中醫(yī)院收治的66例胰腺癌患者的手術(shù)病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2017年《NCCN胰腺癌臨床實(shí)踐指南》[7]中有關(guān)胰腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)接受根治性手術(shù)治療；(3)術(shù)前未行放射治療、化學(xué)治療等抗腫瘤治療；(4)依從性好，隨訪記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非首次診斷的患者；(2)圍手術(shù)期死亡者。66例患者中，男性46例，女性20例，平均年齡為(54.5±6.2)歲。另選擇同期在本院行健康體檢的66位志愿者作為健康對(duì)照，其中男性42人，女性24人，平均年齡為(52.6±5.8)歲。胰腺癌患者與健康對(duì)照組志愿者的性別構(gòu)成、平均年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 血漿及組織中miR-301a-3p檢測(cè)

患者入院后3 d內(nèi)完成靜脈血采集?；颊呋蛑驹刚呔槿≈庹徐o脈血5～10 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血漿后低溫凍存。患者的組織標(biāo)本保存于本院實(shí)驗(yàn)室，每份樣品均包括腫瘤組織及癌旁組織，癌旁組織定義為距離腫瘤邊緣3 cm內(nèi)的組織。使用TRIzol試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)提取組織標(biāo)本和血液標(biāo)本中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)miR-301a-3p相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。RT-RCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔。以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算Ct值，采用2-△△Ct法檢測(cè)miR-301a-3p的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 臨床資料收集

收集患者的病歷資料和手術(shù)記錄，選取指標(biāo)包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有脈管癌栓、糖類抗原19-9(CA19-9)水平及癌胚抗原(CEA)水平等。CA19-9、CEA水平均以入院后第1次腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果為參考，入院后在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，由本院檢驗(yàn)科完成各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，以CA19-9≥37 U/mL、CEA≥5.0 ng/mL為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 隨訪

采用門診復(fù)查或電話的形式進(jìn)行隨訪。術(shù)后每個(gè)月隨訪1次，直至隨訪終點(diǎn)或失訪，總生存期(OS)定義為自手術(shù)當(dāng)日至因任何原因死亡的時(shí)間。隨訪截止時(shí)間為2019年12月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-301a-3p在組織、血漿中的表達(dá)水平

miR-301a-3p在胰腺癌腫瘤組織、癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為10.64±2.12、5.64±1.73，在胰腺癌患者血漿及健康志愿者血漿中的相對(duì)表達(dá)量分別為5.36±1.13、1.28±0.29，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-301a-3p在胰腺癌患者的腫瘤組織與血漿中的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.539，P<0.01)。見圖1。

圖1 各組血漿及組織中miR-301a-3p的相對(duì)表達(dá)量 A 腫瘤組織和癌旁組織 B 胰腺癌患者和健康志愿者的血漿 C 胰腺癌患者的血漿和腫瘤組織

2.2 腫瘤組織中miR-301a-3p的表達(dá)水平對(duì)臨床病理參數(shù)的影響

腫瘤組織中miR-301a-3p的中位表達(dá)水平為10.22，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為miR-301a-3p低表達(dá)組和miR-301a-3p高表達(dá)組。單因素分析結(jié)果顯示，與miR-301a-3p高表達(dá)組患者相比較，miR-301a-3p低表達(dá)組患者中腫瘤直徑<5 cm的患者比例較高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CA19-9水平升高的患者比例則較低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。將單因素分析中有意義的指標(biāo)納入多因素Logistic風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示腫瘤大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA19-9水平是影響腫瘤組織中miR-301a-3p表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表2 腫瘤組織中miR-301a-3p表達(dá)水平對(duì)臨床病理參數(shù)影響的單因素分析

表3 腫瘤組織中miR-301a-3p的表達(dá)水平對(duì)臨床病理參數(shù)影響的多因素分析

2.3 血漿miR-301a-3p與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷的價(jià)值

因變量為二分類變量，對(duì)照組標(biāo)記為0，胰腺癌組標(biāo)記為1，自變量為CEA、CA19-9、血漿miR-301a-3p相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，CEA、CA19-9、miR-301a-3p單獨(dú)診斷胰腺癌時(shí)的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.576、0.693、0.757，三者聯(lián)合診斷時(shí)為0.806，提示聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于單獨(dú)診斷。見表4、圖2。

表4 血漿miR-301a-3p與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷的價(jià)值

圖2 各指標(biāo)診斷胰腺癌的ROC曲線

2.4 miR-301a-3p的表達(dá)水平對(duì)患者OS的影響

Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血漿miR-301a-3p高表達(dá)組患者的OS顯著短于血漿miR-301a-3p低表達(dá)組(χ2=5.524，P=0.018)；組織miR-301a-3p高表達(dá)組患者的OS顯著短于miR-301a-3p低表達(dá)組患者(χ2=22.163，P<0.001)。見圖3。

圖3 miR-301a-3p表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 A 血漿miR-301a-3p B 組織miR-301a-3p

3 討論

胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，具有惡性程度高、預(yù)后差、病死率高等特點(diǎn)[8]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，全世界每年新發(fā)胰腺癌20多萬例[9]。手術(shù)切除是目前胰腺癌的主要治療手段，但由于局部血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者并不適合行根治術(shù)，只能依靠放射治療、化學(xué)治療等輔助手段，這些措施可在一定程度上延長(zhǎng)患者的生命，但療效較差[10]。miRNA作為一種內(nèi)源性非編碼小RNA，具有重要的生物學(xué)功能。有多項(xiàng)研究表明，miRNA與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。Zhang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a-3p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系(HT29和SW620)中顯著上調(diào)。miR-301a-3p的過表達(dá)可明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡。同時(shí)，上調(diào)miR-301a-3p的表達(dá)可升高Bax、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-9、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表達(dá)，使結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲性更強(qiáng)。目前關(guān)于miR-301a-3p與胰腺癌之間關(guān)系的報(bào)道較少。本研究通過分析胰腺癌組織及患者血漿中miR-301a-3p的表達(dá)水平，以期為胰腺癌的臨床治療提供新的思路和方法。

本研究結(jié)果指出，miR-301a-3p在胰腺癌腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織；與健康志愿者相比，胰腺癌患者血漿miR-301a-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，提示胰腺癌會(huì)誘導(dǎo)患者機(jī)體內(nèi)miR-301a-3p異常高表達(dá)。本研究進(jìn)一步分析表明，腫瘤大小、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CA19-9水平是影響腫瘤組織中miR-301a-3p表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-301a-3p的表達(dá)水平與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且對(duì)患者的臨床病理特征有顯著的不良影響。

CEA是從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，是一種具有人類胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來的腫瘤細(xì)胞表面，是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白。CA19-9屬低聚糖腫瘤相關(guān)抗原，是細(xì)胞膜上的糖脂質(zhì)，目前常用于診斷胰腺癌[14]。血清中CA19-9以唾液黏蛋白形式存在，分布于正常成年人的胰腺、膽管上皮等處，是存在于血液循環(huán)中的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原。CEA及CA19-9對(duì)胰腺癌的診斷具有一定特異度，但敏感度并不能滿足臨床檢測(cè)的需求，并且兩者因其非器官特異性，會(huì)影響臨床判斷，因此不能單獨(dú)作為胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，CEA、CA19-9、miR-301a-3p三者聯(lián)合檢測(cè)診斷胰腺癌的準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于單獨(dú)診斷，提示CEA、CA19-9及miR-301a-3p雖然在胰腺癌早期診斷方面具有一定的參考價(jià)值，但三者均不能單獨(dú)作為胰腺癌的早期診斷分子標(biāo)志物，而三者聯(lián)合檢測(cè)可有效提高診斷的敏感度及特異度。本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)，血漿miR-301a-3p高表達(dá)組患者的OS顯著短于血漿miR-301a-3p低表達(dá)組，組織miR-301a-3p高表達(dá)組患者的OS顯著短于miR-301a-3p低表達(dá)組患者，提示miR-301a-3p在組織、血漿中的表達(dá)水平均對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后具有良好的指示作用。本研究的不足之處在于樣本量較小，且為單中心研究，今后將收集更多的樣本進(jìn)一步研究，以期得到更具說服力的證據(jù)。