高效制備霍亂弧菌菌影及其增強(qiáng)豬瘟疫苗免疫效果的研究

姬生樂，韓美晴，杜麗宏，彭名正，徐思艷，楊夢華

（浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

細(xì)菌菌影（Bacterial ghost，BG）是通過在細(xì)菌中表達(dá)噬菌體φX174 裂解E 蛋白使細(xì)菌的內(nèi)外膜融合后形成孔道，由于滲透壓的作用丟失其內(nèi)容物而保留一個(gè)完整的空殼[1]。BG 含有許多天然免疫刺激因子，能有效激活先天性免疫和適應(yīng)性免疫[2-3]。許多研究表明BG 作為免疫佐劑可有效協(xié)助不同的抗原產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。Jiao 等利用腸炎沙門氏菌菌影裝載淋病奈瑟菌DNA 疫苗并在體內(nèi)和體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)顯示，腸炎沙門氏菌菌影可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7 吸收DNA，并且刺激小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性抗體[4]。Eko 等研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌菌影（Vibrio cholerae ghosts，VCG）可以刺激并活化樹突狀細(xì)胞，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞對抗原的應(yīng)答能力[5]。Pan 等以VCG或者CpG+FL 為佐劑，與Pmp18D 蛋白聯(lián)合使用時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌影組T 細(xì)胞活化相關(guān)分子的表達(dá)上調(diào)更明顯[6]。上述研究表明，BG 有望成為一種效果良好的新型免疫佐劑。

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種接觸性傳染病。臨床癥狀表現(xiàn)為高熱，全身多處出血，并以多處出血、梗死和內(nèi)臟器官壞死等為主要病理特征[7]。由于該病高度的傳染性及致病性，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[8]。目前，豬瘟疫苗主要有減毒活性疫苗和亞單位疫苗。豬瘟C 株減毒活疫苗是目前最常用的疫苗，是CSFV 在家兔體內(nèi)反復(fù)傳代獲得的弱毒疫苗，免疫效果較好[9]。豬瘟亞單位疫苗是一種新型疫苗，通常是純化CSFV 的保護(hù)性抗原來作為疫苗使用，如CSFV 囊膜E2 蛋白是亞單位疫苗的主要目標(biāo)蛋白，其中E2 蛋白AD 和BC 區(qū)是誘導(dǎo)CSFV 抗體產(chǎn)生的主要抗原結(jié)構(gòu)域[10]。豬瘟亞單位疫苗僅使用一個(gè)或者多個(gè)抗原，減少傳統(tǒng)疫苗可能引發(fā)的不良反應(yīng)，但亞單位疫苗存在著免疫原性低下的缺點(diǎn)，需要配合佐劑的使用才能發(fā)揮更好效果。鑒于豬瘟對養(yǎng)殖業(yè)造成的嚴(yán)重危害，對增強(qiáng)現(xiàn)有豬瘟疫苗效果以及開發(fā)新型豬瘟疫苗的研究顯得尤為迫切。

VCG 具有很好的免疫原性，并且相較于其它佐劑生產(chǎn)成本低，制備工藝簡單。此外，VCG 可以以凍干粉的形式在室溫下保存和運(yùn)輸，大大降低保存和運(yùn)輸成本。本實(shí)驗(yàn)制備了高裂解率的VCG，并將其分別與豬瘟活疫苗和E2 蛋白主要抗原區(qū)亞單位疫苗聯(lián)合使用，評價(jià)其對豬瘟活疫苗和亞單位抗原免疫效果的影響，以期為今后研發(fā)廉價(jià)高效的疫苗佐劑提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CSFV 石門株囊膜E2蛋白包含AD 與BC 主要抗原區(qū)重組蛋白（2 mg/mL）由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；非O1/139 群霍亂弧菌由本實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV 弱毒株由浙江農(nóng)林大學(xué)王曉杜老師惠贈；pBV220-E 質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)何誠老師饋贈；家兔購自杭州市余杭區(qū)科聯(lián)兔業(yè)。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基經(jīng)典豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）購自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司（江西生物藥廠），生產(chǎn)批號為1801009，每頭份約含15000 RID50的病毒；CSFV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司；弗氏完全佐劑（CFA）購自Sigma 公司；LB 培養(yǎng)基各成分購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 VCG 的制備制備霍亂弧菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[11]，將裂解質(zhì)粒pBV220-E 電轉(zhuǎn)化至霍亂弧菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性菌。參照文獻(xiàn)[12]制備VCG，并通過冷凍干燥制備菌影凍干粉。利用平板活菌計(jì)數(shù)的方法計(jì)算菌影裂解率，計(jì)算公式：[（裂解前活菌數(shù)-裂解后活菌數(shù)）/裂解前活菌數(shù)]×100%。按常規(guī)方法利用透射電鏡觀察VCG。

1.4 不同劑量豬瘟活疫苗免疫家兔的抗體檢測選用18 只健康家兔分為6 組，3 只/組。各組分別經(jīng)頸背部皮下方式注射3000 RID50、1000 RID50、200 RID50、100 RID50和50 RID50的經(jīng)典豬瘟活疫苗，即CSF ST，對照組注射1 mL PBS。免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 和42 d 通過耳緣靜脈采血方式采集兔血并分離血清，利用CSFV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測各組抗體水平變化情況。獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后選擇抗體水平相對較低的豬瘟活疫苗使用劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

1.5 VCG 聯(lián)合豬瘟活疫苗免疫家兔的抗體檢測為探究VCG 作為佐劑對豬瘟活疫苗效果是否有增強(qiáng)作用，選用15 只健康家兔共分為3 組，每組5 只家兔。第一組為對照組，第二組為豬瘟活疫苗組（CSF ST），第三組為109個(gè)細(xì)胞量的VCG 加豬瘟活疫苗組（VCG+CSF ST）。免疫方式、采血時(shí)間、以及抗體檢測同1.4。

1.6 VCG 與E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白聯(lián)合免疫家兔的抗體檢測參照文獻(xiàn)[13]，以600 μg/只純化的E2 蛋白與CFA 混合免疫家兔后，豬瘟抗體生成速率過快，因此按照300 μg/只蛋白量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。為了評價(jià)VCG 對E2 蛋白BC 和AD 主要抗原區(qū)亞蛋白的免疫效果，將15 只健康家兔分為3 組，每組5 只。第一組為對照組；第二組注射300 μg 蛋白加CFA，即CFA（E2）；第三組注射300 μg 蛋白加109個(gè)細(xì)胞量的VCG，即VCG（E2）。頸背部皮下注射免疫，免疫4 次，每次免疫間隔兩周。首次免疫后第21 d、28 d、35 d、42 d、49 d 和56 d 通過耳緣靜脈采血方式采集兔血并分離血清，利用CSFV 阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒檢測抗體水平變化。

1.7 家兔定型熱反應(yīng)檢測上述1.5 和1.6 試驗(yàn)涉及的所有家兔分別在免疫42 d 和56 d 后進(jìn)行CSFV 攻毒實(shí)驗(yàn)，以500 RID50/只的CSFV 弱毒株通過耳緣靜脈對家兔進(jìn)行攻毒，此后每隔6 h 測定家兔直腸溫度，連續(xù)觀察3 d，以判定家兔是否產(chǎn)生定型熱反應(yīng)。定型熱判定標(biāo)準(zhǔn)為，連續(xù)3 個(gè)測溫時(shí)間點(diǎn)高于基礎(chǔ)體溫1 ℃[14]。

2 結(jié) 果

2.1 VCG 的制備及裂解效果評價(jià)將制備的VCG進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)檢測，結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)E 基因表達(dá)前，活菌數(shù)為1.7×107cfu/mL，裂解后活菌數(shù)為4×103cfu/mL，根據(jù)裂解率計(jì)算公式得出細(xì)菌裂解率為99.9%。菌影制備成凍干粉后，取約109細(xì)胞的菌影量涂板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)無活菌生長。透射電鏡觀察可見，表達(dá)E 基因的霍亂弧菌在裂解之后，細(xì)胞失去大部分的細(xì)胞內(nèi)容物，形成了完整細(xì)菌空殼（圖1A），而未表達(dá)E 基因的霍亂弧菌，其細(xì)胞完整（圖1B）。結(jié)果表明，制備的VCG 裂解率高，裂解效果良好。

圖1 VCG(A)與霍亂弧菌(B)透射電鏡結(jié)果Fig.1 TEM images of Vibrio cholerae ghosts(A)and Vibrio cholerae cells(B)

2.2 不同劑量豬瘟活疫苗免疫家兔的抗體檢測利用不同劑量豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）免疫家兔，并監(jiān)測家兔體內(nèi)豬瘟抗體產(chǎn)生的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)使用免疫劑量為50 RID50的豬瘟活疫苗時(shí)，家兔體內(nèi)CSFV 抗體的產(chǎn)生速度相較于其它免疫劑量組顯著降低（p＜0.001），而當(dāng)豬瘟活疫苗接種劑量大于200 RID50時(shí)，相較于免疫劑量較低的實(shí)驗(yàn)組，其抗體產(chǎn)生速度顯著加快（p＜0.001）（圖2）。表明當(dāng)以50 RID50的豬瘟活疫苗免疫家兔，動(dòng)物的抗體生成速率最低，適合觀察VCG 對豬瘟活疫苗刺激家兔后抗體阻斷率的上升趨勢。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用50 RID50的豬瘟活疫苗進(jìn)一步研究VCG 對豬瘟活疫苗免疫效果的作用。

圖2 豬瘟活疫苗免疫家兔的豬瘟抗體水平Fig.2 The blocking rate of serum antibodies in live vaccine immunized rabbits

2.3 VCG 與豬瘟活疫苗聯(lián)合免疫家兔的抗體檢測實(shí)驗(yàn)利用含有或不含有VCG 的50 RID50經(jīng)典豬瘟活疫苗（CSF ST）以及等量的PBS（作為陰性對照）分別免疫家兔一周后，每周采血進(jìn)行抗體檢測。結(jié)果顯示，VCG+CSF ST 組家兔產(chǎn)生的抗體阻斷率在14 d 后的大部分時(shí)間點(diǎn)顯著高于CSF ST 組（p＜0.05）（圖3）。表明VCG 可以增強(qiáng)豬瘟活疫苗的免疫效果，具有良好的佐劑效果。

圖3 VCG 與豬瘟活疫苗聯(lián)合免疫后家兔抗體水平Fig.3 The blocking rate of serum antibodies in immunized rabbits

2.4 VCG 與豬瘟活疫苗聯(lián)合免疫家兔的定型熱反應(yīng)檢測VCG 聯(lián)合豬瘟活疫苗免疫實(shí)驗(yàn)的所有家兔在一免后的42 d 進(jìn)行耳緣靜脈攻毒，攻毒劑量為500 RID50的CSFV 弱毒株。結(jié)果顯示空白對照組的5只家兔均出現(xiàn)了定型熱反應(yīng)，而注射了聯(lián)合VCG 的豬瘟活疫苗和單獨(dú)的豬瘟疫苗的兩組均無定型熱反應(yīng)（表1）。

表1 VCG 與豬瘟活疫苗聯(lián)合免疫家兔的定型熱反應(yīng)Table 1 Fever reactions of the immunized rabbits

2.5 VCG 與E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白聯(lián)合免疫家兔的抗體檢測分別用CFA（E2）、VCG（E2）以及等量的PBS 免疫家兔，免疫后每周采血檢測抗體。結(jié)果顯示，在二免一周后除對照組外均有特異性抗體產(chǎn)生，且均為上升趨勢（p＜0.001）。此外，VCG（E2）組阻斷率略低于弗氏佐劑乳化E2 蛋白主要抗原區(qū)組，然而在免疫后第56 d 后也可達(dá)到80%以上（圖4）。表明了VCG 聯(lián)合E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，引發(fā)了較強(qiáng)的體液免疫。

圖4 VCG 與E2 蛋白亞單位疫苗免疫家兔后的抗體水平Fig.4 The blocking rate of serum antibodies in subunit vaccine immunized rabbits

2.6 VCG 與E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白聯(lián)合免疫家兔的定型熱反應(yīng)檢測所有家兔在免疫56 d 攻毒，方式同2.4。結(jié)果顯示，注射PBS 的5 只家兔產(chǎn)生了定型熱反應(yīng)，而通過VCG（E2）和CFA（E2）免疫的實(shí)驗(yàn)家兔均沒有發(fā)生定型熱反應(yīng)（表2）。

表2 VCG 與E2 蛋白亞單位疫苗聯(lián)合免疫家兔的定型熱反應(yīng)Table 2 Fever reactions of the immunized rabbits

3 討 論

VCG 保留了細(xì)菌的天然抗原成分，能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是一種新型佐劑。與傳統(tǒng)化學(xué)佐劑相比，VCG 不會對機(jī)體造成傷害，具有更好的安全性。有學(xué)者以胸膜肺炎放線桿菌菌影作為佐劑聯(lián)合豬圓環(huán)病毒2 型衣殼蛋白Cap 亞單位疫苗免疫仔豬，發(fā)現(xiàn)菌影佐劑效果優(yōu)于ISA61 佐劑[15]。Macmillan 等利用VCG 同時(shí)呈遞衣原體MOMP 蛋白和皰疹病毒2 型的gD2 蛋白，制備了重組菌影免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠可以產(chǎn)生針對兩種抗原蛋白的特異性抗體[16]。因此，VCG 不僅可以單獨(dú)作為佐劑使用，還可以搭載外源蛋白作為新型載體疫苗使用。

本研究評價(jià)了VCG 作為佐劑對豬瘟活疫苗以及CSFV E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白亞單位疫苗免疫效果的影響。在VCG 的制備實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，所獲得的VCG仍有少量活菌殘留。因此，為進(jìn)一步提高VCG 的生物安全性，實(shí)驗(yàn)將VCG 作凍干處理。活菌平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，處理后的VCG 無活菌殘留。在VCG 聯(lián)合豬瘟活疫苗使用的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VCG 聯(lián)合豬瘟活疫苗組的抗體阻斷率從14 d 后大部分時(shí)間點(diǎn)顯著高于單獨(dú)使用豬瘟活疫苗組。主要原因可能是VCG 可以刺激并活化樹突狀細(xì)胞，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞對抗原的應(yīng)答能力[5]，使得機(jī)體識別豬瘟疫苗的速度加快，從而提高豬瘟疫苗的免疫效果。另外，在VCG 聯(lián)合豬瘟E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CFA（E2）和VCG（E2）兩組的抗體阻斷率均呈上升趨勢，表明了VCG 聯(lián)合E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫。主要原因可能是因?yàn)锽G 可以被樹突狀細(xì)胞有效的攝取并誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，隨后上調(diào)共刺激分子以有效地將蛋白抗原呈遞給幼稚T 細(xì)胞[17]。但是弗氏佐劑組的抗體阻斷率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)略大于VCG 佐劑組，這可能是因?yàn)樽鳛樯虡I(yè)化佐劑的CFA 具有很好的免疫佐劑效果，而VCG 作為一種新型佐劑在劑量使用上有可能并未達(dá)到其最佳值，因而無法發(fā)揮其的最佳佐劑效果。因此，為了提高VCG 作為佐劑的使用效果，在其使用劑量方面仍需進(jìn)一步研究。同時(shí)，在家兔定型熱反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，各個(gè)疫苗組均無家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，而對照組家兔均出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，這也說明豬瘟活疫苗和加了CFA 或者VCG 的E2 蛋白主要抗原區(qū)亞單位疫苗均為家兔提供了一定程度抵抗CSFV 感染的能力。除此之外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)，豬瘟活疫苗各組的抗體生成速率明顯快于亞單位疫苗各組的抗體生成速率，可能是由于豬瘟活疫苗是完整的病毒粒子，在免疫原性方面要優(yōu)于單獨(dú)的CSFV E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白。也有可能是本實(shí)驗(yàn)使用的E2 蛋白劑量較低，這是為了更顯著的區(qū)分CFA 和VCG 的效果差異，但較低的E2 蛋白量可能會使家兔產(chǎn)生抗體的速度變慢，今后需要做進(jìn)一步細(xì)化的研究才能更好的比較豬瘟活疫苗與E2 蛋白亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果。

本研究的結(jié)果均表明，VCG 可以增強(qiáng)豬瘟活疫苗的免疫效果，并且與CSFV E2 蛋白主要抗原區(qū)蛋白聯(lián)合使用可以有效激發(fā)機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了良好的免疫效果。因此，VCG 作為一種新型疫苗佐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。