單核細胞增生李斯特菌重組酶聚合酶恒溫擴增快速檢測方法的建立

周紅蕾，程淑琴，胡永青，劉 靜*

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；3. 河北省農(nóng)業(yè)對外貿(mào)易促進中心，河北 石家莊 050011）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L.monocytogenes），簡稱單增李斯特菌，屬乳酸桿菌科，革蘭氏陽性小桿菌，是一種重要的人畜共患病病原菌，臨床上引起李氏特菌病，表現(xiàn)為：敗血癥、腦膜炎、熱性腸胃炎、流產(chǎn)、肺炎、淋巴結(jié)腫大和單核細胞增多等，通過直接或間接接觸污染物而傳播，致死率高達44%[1]。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，是胞內(nèi)寄生菌，感染動物機體后主要依靠宿主的細胞免疫對其清除，該病主要見于幼畜和免疫力低下的動物群體。由于單增李斯特菌培養(yǎng)營養(yǎng)要求不高，在4 ℃～45 ℃中均能生長，是冷藏食品威脅人畜健康的主要病原菌之一，肉制品或乳制品等食品中存在的單增李斯特菌對人畜的健康有著重大的危害[2]。因此，建立一種快速、靈敏、特異性的單增李斯特菌檢測方法在人畜公共衛(wèi)生安全中尤為重要。

單增李斯特菌的傳統(tǒng)檢測方法為生化培養(yǎng)，雖然該方法檢測的精準性高，但由于樣品中細菌含量通常較低，需要富集培養(yǎng)來提高菌體濃度的前處理步驟，這一過程通常需要12 h～36 h，疑似樣品到最終確定耗時久，因此無法廣泛推廣應(yīng)用。而分子生物學(xué)方法因其檢測速度快、靈敏度高而被廣泛研究并應(yīng)用。重組酶聚合酶等溫擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)是一種可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)無需昂貴的PCR 儀，反應(yīng)速度快，靈敏度高，擴增產(chǎn)物可以與瓊脂糖凝膠電泳終點法、熒光定量實時檢測法、測流層析試紙條等方法結(jié)合起來進行檢測，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測[3-6]。本研究基于單增李斯特菌基因組序列設(shè)計特異性識別引物，利用RPA技術(shù)建立了單增李斯特菌快速、特異、靈敏的檢測方法，適用于基層實驗室和現(xiàn)場快速檢測，是人畜公共衛(wèi)生安全監(jiān)測的重要手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料單增李斯特菌（ATCC 19115）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii，ATCC 19119）、無害李斯特菌（Listeria innocua，ATCC 33090）、斯氏李斯特菌（Listeria seeligeri，ATCC 35967）、格氏李斯特菌（Listeria grayi，ATCC 25401）、腸致病性大腸埃希菌O157（Escherichia coli O157，ATCC 43888）、沙門氏菌（Salmonella enteritidis，ATCC 14028）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，ATCC 14579）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）均購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；TwistAmp?Basic kit購自英國TwistDX公司；HiPure Bacterial DNA Kit、HiPureMicro-Biome DNA Kit 和HiPure Gel Pure Micro Kit 購自廣州美基生物科技有限公司；Marker III 購自天根生化科技（北京）有限公司；TB Green?Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus），Bulk 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 引物設(shè)計根據(jù)GenBank 已公布的單增李斯特菌（CP025567.1）基因組DNA 序列，按照RPA 引物設(shè)計原則設(shè)計引物，序列如下：LM-F：5'-AAATAGA ATAGGAACCCTGCTACTAAAATC-3'/LM-R：5'-GCA AGTAACATAGAAACACCTCTCCTTCAA-3'。引物由通用生物（安徽）有限公司合成。

1.3 RPA 反應(yīng)體系和程序的建立利用HiPure Bacterial DNA Kit 提取單增李斯特菌的基因組DNA，以其為模板，利用TwistAmp?Basic kit 反應(yīng)體系如下：LM-F（10 μmol/L）2.1 μL、LM-R（10 μmol/L）2.1 μL、2×Reaction Buffer 25 μL、10×Basic E-mix 5 μL、dNTP（1.8 mmol/L）2.25 μL、細菌基因組1 μL、ddH2O 7.55 μL、20×core Reaction mix 2.5 μL、MgOAc（280 mmol/L）2.5 μL 共50 μL 反應(yīng)體積，同時設(shè)置陰性對照，充分混勻后將反應(yīng)體系在37 ℃條件下孵育30 min。按照HiPure Gel Pure Micro Kit 產(chǎn)品說明書對擴增產(chǎn)物進行純化，純化后的擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 RPA 最適反應(yīng)溫度和時間的優(yōu)化配置RPA反應(yīng)體系，同時設(shè)置陰性對照，在37 ℃條件下，采用方陣法進行最適反應(yīng)時間篩選（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）和最適反應(yīng)溫度篩選（25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃、45 ℃）。

1.5 特異性試驗利用HiPure Bacterial DNA Kit 提取伊氏李斯特菌、無害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、腸致病性大腸埃希菌O157、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，利用建立的RPA 方法對單增李斯特菌及其它常見病原微生物基因組DNA 進行檢測，以評價該反應(yīng)體系的特異性。

1.6 敏感性試驗將提取的單增李斯特菌基因組DNA（3×106拷貝/μL）10 倍倍比稀釋，以3×106拷貝/μL～3×100拷貝/μL 基因組DNA 為模板，同時設(shè)置陰性對照，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對其擴增。

對單增李斯特菌菌液（106cfu/mL）進行10 倍倍比稀釋，制成106cfu/mL～100cfu/mL 的樣品，各取1 mL 提取的基因組DNA 為模板按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對其擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確定該方法的敏感性。

1.7 人工污染樣品的檢測鮮牛奶、牛肉、魚肉均從當(dāng)?shù)爻匈徺I，按照國標（GB 4789.30-2016）的方法檢測，證實不含單增李斯特菌，可用于后續(xù)人工污染樣本的建立。量取50 mL 鮮牛奶分成50 份，即1 mL/份，隨機選取10份摻入單增李斯特菌至終濃度為106cfu/mL。稱取牛肉、魚肉樣品各10 g，加入90 mL生理鹽水中勻漿，取上清分成50 份，即1 mL/份，隨機選取10 份摻入單增李斯特菌至終濃度為106cfu/mL，利用HiPureMicroBiome DNA Kit 提取上述樣品的基因組DNA。應(yīng)用RPA 方法和熒光定量PCR（qPCR）方法[7]對污染樣本進行快速檢測，同時利用國標（GB 4789.30-2016）檢測方法作為對照，以驗證該方法的適用性。

2 結(jié) 果

2.1 單增李斯特菌RPA 擴增結(jié)果利用設(shè)計的特異性引物L(fēng)M-F/LM-R 對單增李斯特菌DNA 進行RPA擴增，對擴增產(chǎn)物進行柱純化。擴增結(jié)果顯示獲得一條約320 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符（圖1）。表明特異性引物L(fēng)M-F/LM-R可用于檢測單增李斯特菌。

圖1 單增李斯特菌目的基因的RPA 擴增結(jié)果Fig.1 Amplification of L.monocytogenes target gene by RPA

2.2 RPA 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果使RPA 反應(yīng)體系在37 ℃條件下，采用方陣法篩選最適反應(yīng)時間和最適反應(yīng)溫度，結(jié)果顯示反應(yīng)時間在15 min～30 min 之間均可獲得約320 bp 大小的目的片段，而5 min 的反應(yīng)時間下無擴增，10 min 的反應(yīng)時間下可獲得微弱的目的條帶（圖2）。因此，最終確定15 min 為最適反應(yīng)時間。

圖2 單增李斯特菌RPA 檢測體系最適反應(yīng)時間篩選Fig.2 Optimal amplification time of the RPA system targeting L.monocytogenes

反應(yīng)溫度在25 ℃～45 ℃之間均可獲得約320 bp大小的目的片段，當(dāng)反應(yīng)溫度在42 ℃時擴增產(chǎn)量最高，37 ℃時產(chǎn)物量略減少，而25 ℃、30 ℃和45 ℃時擴增產(chǎn)物較低（圖3）。因此，最終確定42 ℃為最適反應(yīng)溫度。

圖3 單增李斯特菌RPA 檢測體系最適反應(yīng)溫度篩選Fig.3 Optimal amplification temperature of the RPA system targeting L.monocytogenes

2.3 特異性試驗結(jié)果對單增李斯特菌及伊氏李斯特菌、無害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、腸致病性大腸埃希菌O157、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA 進行RPA 檢測，結(jié)果顯示，該方法僅對單增李斯特菌擴增獲得約320 bp 大小的目的片段，而對其他細菌基因組DNA 均無特異性擴增（圖4）?？梢娫摲椒軌蛱禺愋缘臄U增致病性的單增李斯特菌，但對其它常見的食源性微生物和非致病性的李斯特菌無擴增。表明該方法特異性較強。

圖4 特異性試驗結(jié)果Fig.4 Specificity test of the RPA system targeting L.monocytogenes

2.4 敏感性試驗結(jié)果分別以10 倍倍比稀釋的基因組DNA 3×106拷貝/μL～3×100拷貝/μL 和106cfu/mL～100cfu/mL 菌液1 mL 提取的基因組DNA 為模板，進行敏感性試驗。結(jié)果顯示該RPA 檢測系統(tǒng)的最低檢出限分別為3×102拷貝/μL（圖5A）和103cfu/mL（圖5B），表明單增李斯特菌RPA 方法敏感性較高。

圖5 敏感性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of the RPA system targeting to L.monocytogenes

2.5 人工污染樣品的檢測結(jié)果應(yīng)用本研究建立的單增李斯特菌RPA 方法和已報道的qPCR 方法分別對人工污染的50 份鮮牛奶、50 份牛肉勻漿和50 份魚肉勻漿樣品進行檢測，結(jié)果顯示，各污染樣品檢出率均為20%，各樣品均有10 份陽性樣品，RPA 方法與qPCR 方法和國標法檢測結(jié)果一致，表明RPA方法可以用于臨床樣品的單增李斯特菌污染測定。

3 討 論

單增李斯特菌被世界衛(wèi)生組織（WHO）列入20世紀90 年代食品污染的重要致病菌，廣泛存在于各類肉制品、水產(chǎn)品、奶制品等。單增李斯特菌的傳統(tǒng)的檢測方法包括前增菌、分離培養(yǎng)、生化實驗等復(fù)雜的檢測流程，不僅需要較長的鑒定時間，而且檢測通量低，無法滿足細菌性疾病暴發(fā)和食物中毒等臨床快速檢驗。因此，分子生物學(xué)診斷技術(shù)在很多應(yīng)用性檢測中逐漸替代了傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)診斷。目前，基于分子生物學(xué)技術(shù)檢測單增李斯特菌的研究有很多。楊國興等人基于單增李斯特菌內(nèi)化素基因（inlA）設(shè)計特異性引物，建立了多重PCR 檢測方法同時檢測多種病原微生物[8]。該方法可以同時檢測4 種食源性病原微生物，檢測時間為2 h，靈敏度為103cfu/mL。然而該實驗依賴于溫度梯度PCR 儀，限制了在實驗設(shè)備匱乏的應(yīng)用場景。O'Grady 等以單增李斯特菌ssr A 基因設(shè)計引物，建立了qPCR 檢測方法，并測定了天然和人工染菌的食物中的單增李斯特菌[9]。雖然qPCR 實驗技術(shù)將檢測控制在1.5 h 以內(nèi)，但該實驗不僅需昂貴的實時熒光定量PCR 儀器，而且對樣本純度要求非常高，模板中的雜質(zhì)會抑制DNA 聚合酶的活性，影響擴增熒光信號的強度[10]。王瑞娜等通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）擴增單增李斯特菌的inlA 基因，并通過橫向流動試紙條來檢測擴增的核酸產(chǎn)物[11]。雖然LAMP 技術(shù)對實驗設(shè)備要求低，僅需要一臺可設(shè)定為65 ℃恒溫水浴鍋即可完成實驗，適合于基層檢測，但該方法也存在了一定的弊端。一方面，引物設(shè)計時需要選定6 個獨立的區(qū)域設(shè)計2對特殊的引物，增加了引物設(shè)計的難度。另一方面，反應(yīng)結(jié)果的判定根據(jù)肉眼觀察擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度，易出現(xiàn)誤判的情況[12]。

近年由于RPA 技術(shù)的興起，被廣泛應(yīng)用于多種病原生物的檢測。姜一曈等基于犬細小病毒VP2 基因的保守序列設(shè)計特異性引物，建立了犬細小病毒的RPA 快速檢測方法[13]。而單增李斯特菌的RPA 檢測應(yīng)用研究較少。RPA 技術(shù)成功的關(guān)鍵在于引物設(shè)計，其設(shè)計基本原則與普通PCR 相似，但也有不同之處。根據(jù)TwistAmp?Basic kit 的說明書中關(guān)于引物設(shè)計的指導(dǎo)原則：引物長度介于30 bp～36 bp，靶標區(qū)域GC含量介于20%～70%，Tm值介于50 ℃～100 ℃，為降低引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)生成，可適當(dāng)引入錯配堿基，同時擴增產(chǎn)物長度不超過500 bp。本研究在單增李斯特菌基因組上篩選得到的最佳引物，正反向引物長度均為30 bp，擴增產(chǎn)物大小約320 bp，軟件分析發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體自由能均較低，保證了RPA 檢測方法實施的可行性。雖然病原性檢測診斷時選取毒力基因是較為常見的研究手段，如：單增李斯特菌的inlA 基因[8,11]，可以特異性檢測到致病性病原菌，但另一方面也局限了引物設(shè)計。本研究在單增李斯特菌全基因組上篩選引物對，能夠特異性的擴增致病性的單增李斯特菌，但對其它常見的食源性微生物和非致病性的李斯特菌無擴增。

與普通PCR 技術(shù)和qPCR 技術(shù)相比，RPA 最顯著的特點是不依賴于高精密的溫控PCR 儀，無需高溫模板變性和引物退火，僅需要在25 ℃～45 ℃低溫條件下利用重組酶、鏈置換酶完成核酸的擴增[7]。因此，減少了升降溫的過程，縮短了反應(yīng)時間。本研究建立的單增李斯特菌的RPA 檢測方法在15 min即可獲得準確的檢測結(jié)果，遠快于其它分子生物學(xué)實驗技術(shù)。在RPA基礎(chǔ)擴增體系內(nèi)加入不同的探針、修飾的引物，可以實現(xiàn)多樣化檢測。李林等根據(jù)非洲豬瘟病毒（ASFV）基因組序列設(shè)計特異性引物和exo 探針，建立了檢測ASFV 的實時熒光RPA 方法[14]。樊曉旭等根據(jù)塞尼卡谷病毒（SVV）基因組序列設(shè)計特異性的生物素標記的引物和FAM 熒光基團修飾的探針，建立了檢測SVV 的RPA-側(cè)流層析試紙條可視化檢測方法[15]。為模擬實際檢測場景，本研究選取了無單增李斯特菌污染的牛奶、牛肉、魚肉樣品，建立了人工污染實驗樣本模型。將RPA 檢測結(jié)果與qPCR 方法檢測結(jié)果進行比較，獲得了一致性的檢測結(jié)果，證實了建立的單增李斯特菌RPA 方法的準確性。

本研究建立一種用于檢測單增李斯特菌的RPA方法，反應(yīng)速度快、特異性強、靈敏度高、檢測流程簡單，能夠進行實時實地的現(xiàn)場檢測，滿足單增李斯特菌引起的疾病暴發(fā)和食物中毒等多種應(yīng)用場景診斷。