弗勞地枸櫞酸桿菌分離鑒定及其三重PCR 檢測(cè)方法的建立

張楠馳，王 利*

（1. 西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2. 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

弗勞地枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）為腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬的革蘭氏陰性桿菌，其菌體形態(tài)與大腸埃希菌相似，有鞭毛無芽孢無莢[1]。弗勞地枸櫞酸桿菌在臨床中是一種較常見的條件致病菌，在機(jī)體免疫力低下時(shí)，可能引起體表傷口組織或體內(nèi)組織感染，如引起人類的腦膿腫、高死亡率的菌血癥以及呼吸道、消化道、泌尿系統(tǒng)感染等疾病[2-3]。羅琳等從腎病患者尿液中分離到該菌[4]，Chen 等報(bào)道了9 名新生兒由該菌引起敗血癥的研究[5]。感染弗勞地枸櫞酸桿菌對(duì)動(dòng)物的健康也存在一定威脅。王利等在2011 年首次從患病鯽魚腸道中分離出弗勞地枸櫞酸桿菌[6]，Goldberg 等發(fā)表了一例海龜感染弗勞地枸櫞酸桿菌而致死的報(bào)道[7]。同時(shí)，弗勞地枸櫞酸桿菌與散發(fā)和爆發(fā)腹瀉有關(guān)，對(duì)人的食品安全和動(dòng)物的飼料安全帶來威脅[8-9]。因此，高效、準(zhǔn)確、快速地鑒定弗勞地枸櫞酸桿菌非常重要。本實(shí)驗(yàn)室2018 年10 月在成都某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)一批嘴部有乳白色潰爛傷口、肛門紅腫、腹部有出血點(diǎn)的患病鯽魚，本研究對(duì)其分離得到菌株fsznc-08，進(jìn)行了常規(guī)分子生物學(xué)鑒定，確證其為弗勞地枸櫞酸桿菌。進(jìn)一步針對(duì)該菌的GalF 基因、petA 基因和FliC 基因設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性引物，建立一種可以快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)該菌的三重PCR 方法，以期為臨床中弗勞地枸櫞酸桿菌的檢測(cè)提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病原菌、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、鏈球菌（Streptococcus）、殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、廈門希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomons shigelloides）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）、無丙二酸枸櫞酸桿菌（Citrobacter amalonaticus）均保種于西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

患病鯽魚來自成都某養(yǎng)殖場(chǎng)，其臨床癥狀為嘴部有乳白色潰爛傷口、肛門紅腫、腹部有出血點(diǎn)；健康成年鯽魚（500±50 g）和鯽魚魚苗（75±25 g）購(gòu)自成都某市場(chǎng)。LB 培養(yǎng)基、MBS 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；PCR 聚合酶（1.1×T3 Super PCR Mix）、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 病原菌的分離、培養(yǎng)和生理生化鑒定利用無菌接菌環(huán)在病魚嘴部傷口取樣并接種于LB 固態(tài)培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h 后挑取外觀一致的單菌落，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌純化培養(yǎng)。采用革蘭氏染色法對(duì)細(xì)菌菌體進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察其顏色和形狀。采用細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行生化鑒定，鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[1]。

1.3 分離菌16S rDNA 擴(kuò)增及序列分析利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌總DNA 為模板，采用16S rDNA 通用引物（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/CTACGGCTACCTTGTTACGA）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃2 min；98 ℃10 s、55 ℃10 s、72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司雙向測(cè)序并拼接。取得拼接后的16S rDNA 序列后，提交至GenBank 獲取登錄號(hào)，并在GenBank 上進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，利用Mega 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 分離菌回歸感染試驗(yàn)采用常規(guī)方法收集分離菌體，用滅菌生理鹽水制備濃度為3×109cfu/mL 的菌懸液，選取健康成年鯽魚（500±50 g）和鯽魚魚苗（75±25 g）各10 尾，分別經(jīng)腹腔注射0.1 mL 菌懸液，另選取10 尾健康鯽魚腹腔注射0.1 mL 生理鹽水作對(duì)照，飼養(yǎng)7 d 觀察發(fā)病和死亡情況。對(duì)病魚和死魚解剖，取嘴部潰爛組織和腸道內(nèi)容物涂布于LB 固態(tài)培養(yǎng)基，并對(duì)生長(zhǎng)出的菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。

1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank 登錄的弗勞地枸櫞酸桿菌GalF 基因、petA 基因和FliC 基因序列，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)3 對(duì)特異性引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，工作濃度均為10 μmol/L。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.6 單一PCR 反應(yīng)條件的建立各基因單一PCR總體系為25 μL，各組分含量分別為：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，分離菌DNA 模板1 μL，各基因各上下游引物1 μL。反應(yīng)條件：98 ℃2 min；98 ℃10 s、（45 ℃～64 ℃）15 s、72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 擴(kuò)增結(jié)果，確定三對(duì)引物的共同最佳退火溫度。

1.7 三重PCR 反應(yīng)條件的建立根據(jù)1.6 建立的單一PCR 擴(kuò)增條件，采用方陣法對(duì)三重PCR 各引物比例（從1∶1∶1 開始，通過觀察擴(kuò)增目的條帶的亮度，調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)引物對(duì)的添加比例），退火溫度（45 ℃～64 ℃范圍16 個(gè)溫度梯度）進(jìn)行篩選。采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

1.8 特異性試驗(yàn)采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的各菌種基因組作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行三重PCR 擴(kuò)增，設(shè)無菌水為陰性對(duì)照，分離菌株fsznc-08為陽(yáng)性對(duì)照，以檢測(cè)該方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn)采用分光光度法檢測(cè)分離菌基因組DNA 濃度后，用無菌去離子水10 倍倍比稀釋（102～1011）后分別作為模板，按照建立的三重PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的敏感性。

1.10 多重PCR 檢測(cè)法的臨床應(yīng)用采用1.5 的方法人工回歸感染鯽魚15 尾，發(fā)病后采集病樣并提取細(xì)菌DNA。利用本實(shí)驗(yàn)建立的三重PCR 檢測(cè)方法檢測(cè)樣品，并采用文獻(xiàn)[10]建立的弗勞地枸櫞酸桿菌PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)檢，驗(yàn)證二者之間的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌的形態(tài)學(xué)和理化特性鑒定結(jié)果分離菌接種LB固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)后可見直徑為2 mm～4 mm，邊緣整齊的灰白色菌落。革蘭氏染色可見多數(shù)成對(duì)或成片排列的紅色桿狀菌體，表明該菌為革蘭氏陰性桿菌。該菌理化特性試驗(yàn)結(jié)果詳見表2。該分離菌菌株形態(tài)學(xué)和理化特性與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[1]中關(guān)于弗勞地枸櫞酸桿菌的描述基本一致，將其命名為fsznc-08。

表2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiology biochemical characteristics

2.2 分離菌16S rDNA 擴(kuò)增及序列分析結(jié)果16S rDNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后結(jié)果顯示，得到約為1 500 bp 的片段。經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株16S rDNA 片段長(zhǎng)度為1 406 bp。將分離菌株16S rDNA 基因序列提交到GenBank 中獲得登錄號(hào)MN159062。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株fsznc-08 的16S rDNA 基因序列與Citrobacter freundii BAC007 的16S rDNA 基因序列置信度為100（圖1），結(jié)合分離菌株形態(tài)學(xué)和理化特性，綜合判定菌株fsznc-08 為弗勞地枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）。

圖1 菌株fsznc-08 16S rDNA 基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain fsznc-08 16S rDNA gene sequence and its relatives

2.3 分離菌動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果健康鯽魚經(jīng)腹腔注射菌株fsznc-08，進(jìn)行動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，感染成魚組2 d 內(nèi)死亡2 尾，7 d 內(nèi)死亡8 尾，其余2尾均出現(xiàn)體表潰爛的癥狀；感染魚苗組2 d 內(nèi)死亡10 尾；對(duì)照組未見異常或死亡魚。死亡和病魚癥狀表現(xiàn)為嘴部嚴(yán)重潰爛、頭部局部皮膚完全缺失、肛門紅腫、部分腹部有出血點(diǎn)、胃腸充血，癥狀與自然感染的病魚相似。采集病魚嘴部潰爛組織和腸道內(nèi)容物，可分離到大量與fsznc-08 菌落形態(tài)相似的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)其為弗勞地枸櫞酸桿菌。表明本研究分離的弗勞地枸櫞酸桿菌fsznc-08株為本次疾病的致病菌。

2.4 單一PCR和三重PCR擴(kuò)增結(jié)果將各引物進(jìn)行單一PCR 擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度約為110 bp、270 bp 和540 bp 的條帶（圖2）。經(jīng)測(cè)序，GalF-1、petA-4 和FliC-2 分別為106 bp、261 bp 和536 bp，與對(duì)應(yīng)參考序列同源性分別為97%、99%和97%，均與預(yù)期結(jié)果一致。

經(jīng)優(yōu)化，三重PCR最佳反應(yīng)體系為：1.1×T3 Super PCR Mix，19 μL；菌株fsznc-08 DNA模板，2 μL；引物量分別為：GalF-1F 0.8 μL，GalF-1R 0.8 μL，petA-4F 0.4 μL，petA-4R 0.4 μL，F(xiàn)liC-2F 0.8 μL，F(xiàn)liC-2R 0.8 μL。最佳反應(yīng)條件為：98 ℃2 min；98 ℃10 s、47.8 ℃15 s、72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。按照上述反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)得到約530 bp、260 bp 和110 bp 的目的片段（圖2）。

圖2 特異性引物擴(kuò)增Fig.2 PCR amplifications withspecific primers

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)該三重PCR 方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，僅菌株fsznc-08 基因組DNA經(jīng)三重PCR 擴(kuò)增出現(xiàn)3 條清晰目的條帶，片段大小分別為106 bp、261 bp 和536 bp ，而鏈球菌、殺魚愛德華氏菌、霍亂弧菌、溫和氣單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、廈門希瓦氏菌、維氏氣單胞菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、類志賀鄰單胞菌、霍氏腸桿菌和無丙二酸枸櫞酸桿菌的基因組DNA 經(jīng)三重PCR 擴(kuò)增均未擴(kuò)增出3 條目的條帶（圖3）。表明建立的多重PCR 方法特異性好。

圖3 三重PCR 的特異性試驗(yàn)Fig.3 The specificity test of the triplex PCR assay

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果以不同稀釋度的菌株fsznc-08 基因組DNA 為模板進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，多重PCR 對(duì)GalF-1、petA-4 和FliC-2 的最低檢出限分別為3.08×100拷貝/μL、1.25×100拷貝/μL和6.09×101拷貝/μL（圖4）。表明本研究建立的三重PCR 方法敏感性較高。

圖4 三重PCR 敏感性試驗(yàn)Fig.4 The sensitivity test of the triplex PCR assay

2.7 三重PCR 檢測(cè)方法臨床應(yīng)用結(jié)果采用本實(shí)驗(yàn)建立的三重PCR 檢測(cè)方法對(duì)15 尾病魚腸道內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，14 個(gè)樣品呈陽(yáng)性（圖5），陽(yáng)性檢測(cè)率約為93.33%。同時(shí)，采用文獻(xiàn)[10]PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果一致（圖6）。表明本實(shí)驗(yàn)建立的三重PCR 方法適合應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)。

圖5 臨床樣品三重PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of clinical samples by triplex PCR assay

圖6 臨床樣品單一PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Detection results of clinical samples by single PCR

3 討 論

近年來人類和動(dòng)物感染弗勞地枸櫞酸桿菌的報(bào)告逐年增加，成為臨床中常見致病菌之一[11]。王利、石征宇、張冬星和王家禎等分別從患病鯽魚腸道、羅非魚心臟、團(tuán)頭魴肝和青魚肝中分離到該菌[6,12-14]。石征宇等研究表明，弗勞地枸櫞酸桿菌對(duì)羅非魚、草魚、黃顙魚和禾花鯉具有較強(qiáng)的致病性[12]。弗勞地枸櫞酸桿菌作為人畜生存環(huán)境中的條件致病菌，營(yíng)養(yǎng)不良、機(jī)體免疫力較差成為該菌的主要易感因素[15-16]。養(yǎng)殖動(dòng)物感染弗勞地枸櫞酸桿菌，不但會(huì)影響動(dòng)物健康和養(yǎng)殖環(huán)境，其作為一種食源性致病菌也對(duì)人類食品安全造成較大的威脅。采用快速檢測(cè)的方法可在生產(chǎn)中預(yù)防由勞地枸櫞酸桿菌引起的細(xì)菌污染，可在一定程度上預(yù)防由該菌引起的食源性疾病。

快速檢測(cè)細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有常規(guī)PCR 技術(shù)、多重PCR 技術(shù)。常規(guī)PCR 技術(shù)主要是擴(kuò)增細(xì)菌的一條特異性基因。譚秋杉等通過擴(kuò)增部分16S rDNA 基因保守序列鑒定不同血清型鴨疫里默氏桿菌[17]。畢水蓮?fù)ㄟ^擴(kuò)增部分弓形菌23S rDNA 基因序列鑒定該菌[18]。而不同細(xì)菌間16S rDNA 基因、23S rDNA 基因序列具有一定同源性，這將對(duì)該檢測(cè)方法的特異性產(chǎn)生一定的影響。多重PCR 技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等特點(diǎn)，與常規(guī)PCR技術(shù)相比具有更高的特異性和敏感性，在細(xì)菌快速檢測(cè)方法有著重要的臨床意義和廣泛的應(yīng)用前景。劉變芳等構(gòu)建的生鮮肉產(chǎn)毒素大腸桿菌多重PCR 檢測(cè)法，可快速、批量地篩選出可疑ETEC（產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌）污染的樣品[19]。丁天翊等建立的多重PCR 方法可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出奶牛乳房炎4 種病原菌[20]。影響多重PCR 檢測(cè)的效果的因素有很多，模板濃度、引物特異性和穩(wěn)定性等均會(huì)影響檢測(cè)效果。目前，已有多種形式的多重PCR 檢測(cè)方法，如利用多條毒力基因檢測(cè)一種或多種細(xì)菌[21]、利用數(shù)條特異性基因同時(shí)檢測(cè)數(shù)種細(xì)菌[20]等，此類方法通過一條特異性基因或多條非特異性基因（如毒力基因、16S rDNA 和23S rDNA 序列）判斷樣品中是否含有目的細(xì)菌，但檢測(cè)方法的特異性和準(zhǔn)確性欠佳。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)基因GalF、petA 和FliC 的引物，引物均通過BLAST 比對(duì)和篩選，比對(duì)結(jié)果中只包含弗勞地枸櫞酸桿菌序列，同時(shí)采用這3 對(duì)特異性引物擴(kuò)增GalF、petA 和FliC 基因能夠快速檢測(cè)出弗勞地枸櫞酸桿菌，并且本實(shí)驗(yàn)方法在臨床應(yīng)用中得到驗(yàn)證。綜合引物特異性、敏感性試驗(yàn)和臨床應(yīng)用結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)弗勞地枸櫞酸桿菌的三重PCR 檢測(cè)法可在2 h 內(nèi)完成檢測(cè)，同時(shí)降低了鑒定細(xì)菌的成本，具有良好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)從病鯽魚中分離出弗勞地枸櫞酸桿菌，經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)驗(yàn)證了該菌株為病原菌，并建立了一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)弗勞地枸櫞酸桿菌的三重PCR 方法，該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)單、成本低的特點(diǎn)。本研究為弗勞地枸櫞酸桿菌的快速檢測(cè)提供了可行方法。