鼠傷寒沙門菌伴侶蛋白Hfq 調(diào)控基因的篩選

潘 永，李 晨，楊 陽，劉麗娟，楊 琦,4*

（1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省畜禽資源遺傳管理站，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學(xué) 動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；4. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；5. 都勻市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 都勻 558000）

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium LT2，STM LT2）是腸道沙門菌中較為重要的一個(gè)血清型，因其感染宿主廣泛且可引起人和動(dòng)物嚴(yán)重的胃腸炎，長期以來給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。沙門菌的致病機(jī)制較復(fù)雜，如III 型分泌系統(tǒng)將超過30 種特化效應(yīng)蛋白遞送到宿主細(xì)胞中以破壞宿主細(xì)胞細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、膜運(yùn)輸和促炎反應(yīng)[1]。ABC 型超家族（ATP-binding cassette superfamily）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Oligopeptide permease，Opp）、二肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Dipeptide permease，Dpp），它們行使功能需要在ATP 水解產(chǎn)生能量的情況下實(shí)現(xiàn)，在細(xì)菌生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和趨化性上發(fā)揮重要作用。細(xì)菌的群體感應(yīng)是細(xì)胞與細(xì)胞之間通信的過程，細(xì)菌通過產(chǎn)生、分泌和檢測被稱為自誘導(dǎo)物的細(xì)胞外信號分子來評估其種群密度，從而協(xié)調(diào)基因的表達(dá)。細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路以及群體感應(yīng)通路與細(xì)菌的致病機(jī)制有著密切聯(lián)系，而這種關(guān)系可能通過某些共表達(dá)基因聯(lián)結(jié)[2-4]。

Hfq 是一種非編碼小RNA 結(jié)合伴侶蛋白，在多種細(xì)菌中存在，并且在控制基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。Hfq 通過促進(jìn)非編碼小RNA 與其靶mRNA 的配對影響特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯和轉(zhuǎn)換率來調(diào)控復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后網(wǎng)絡(luò)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明hfq 基因的缺失導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌的毒力、侵襲力、生長速度和運(yùn)動(dòng)力顯著降低，Hfq 在多種細(xì)菌的致病機(jī)制、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路和群體感應(yīng)的控制中扮演重要角色[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期利用Hiseq 測序平臺(tái)對鼠傷寒沙門菌LT2 hfq 缺失株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對數(shù)期共516 個(gè)基因上調(diào)，539 個(gè)基因下調(diào)，穩(wěn)定期共496 個(gè)基因上調(diào)，463 個(gè)基因下調(diào)[6]。由于基因數(shù)目較多且在對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平的差異顯著性相差較大，而細(xì)菌在不同的生長時(shí)期有著不同的調(diào)控活動(dòng)，因此需對鼠傷寒沙門菌hfq基因敲除后不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選。許多研究表明，依賴Hfq 發(fā)揮作用的sRNA 中，如主要調(diào)控細(xì)菌氨基酸攝取與合成相關(guān)基因表達(dá)的GcvB，當(dāng)hfq基因敲除后，GcvB所調(diào)控的靶基因及Hfq 直接調(diào)控的靶基因在細(xì)菌不同生長期仍表現(xiàn)為相同趨勢的差異表達(dá)[7-8]，這為本研究篩選Hfq 調(diào)控的相關(guān)基因提供了理論前提。

本研究基于前期對指數(shù)生長期和穩(wěn)定期的鼠傷寒沙門菌hfq 基因敲除株轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，從篩選的差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選6 個(gè)，利用熒光定量PCR 檢測表達(dá)量，以此驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性，并在驗(yàn)證結(jié)果可靠的前提下分別將對數(shù)期和穩(wěn)定期篩選為差異表達(dá)的基因注釋到GO terms 細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程以及Pathway 細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路和群體感應(yīng)兩大信號通路，以期篩選在對數(shù)期和穩(wěn)定期均表現(xiàn)為差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，疑似受sRNA 伴侶蛋白Hfq 所調(diào)控的基因。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料野生型STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株（STM LT2 wild）由法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi 實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。STM LT2 hfq 基因缺失株（STM LT2 △hfq::cat）由 本 實(shí) 驗(yàn) 室 構(gòu) 建。RNA 提 取 試 劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMII1st strand cDNA Synthesis Kit 以及熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 差異表達(dá)基因熒光定量PCR 檢測將STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株和STM LT2 hfq 基因缺失株分別培養(yǎng)至對數(shù) 期（OD600nm≈0.4）和 穩(wěn) 定 期（OD600nm≈2.0），利 用Trizol 試劑分別提取標(biāo)準(zhǔn)株和缺失株不同時(shí)期的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，選擇GAPDH 作為內(nèi)參基因，參照文獻(xiàn)[6]結(jié)果隨機(jī)選取6個(gè)差異表達(dá)基因dppA、spaP、prgH、mgtC、eutH、invG，利用文獻(xiàn)[6]中相應(yīng)的6 對引物進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)重復(fù)，樣本數(shù)值按照2-ΔΔct法計(jì)算相關(guān)基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，對比相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄組測序與熒光定量PCR 結(jié)果是否有一致性，若數(shù)據(jù)可靠則進(jìn)行后續(xù)研究。引物均由上海英濰捷基公司合成。

1.3 GO 富集細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程篩選Hfq 調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠的前提下，將前期分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的差異表達(dá)基因通過注釋GO terms 中的致病機(jī)制生物學(xué)過程（Pathogenesis，GO：0009405），篩選受Hfq 調(diào)控的基因，保留對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)以STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株作為對照。

1.4 Pathway 富集細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路篩選Hfq 調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠的前提下，將前期分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的差異表達(dá)基因通過KEGG 注釋Pathway 富集細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn) 運(yùn) 通 路（ABC transporters， Pathway ID：ko02010），篩選受Hfq 調(diào)控的基因。保留對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)以STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株作為對照。

1.5 Pathway 富集細(xì)菌群體感應(yīng)通路篩選Hfq 調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠的前提下，將前期分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因通過KEGG 注釋Pathway 富集細(xì)菌群體感應(yīng)通路（Quorum sensing，Pathway ID：ko02024），篩選受Hfq 調(diào)控的基因。保留對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)以STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株作為對照。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR 驗(yàn)證結(jié)果從兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中隨機(jī)挑取6 個(gè)轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因dppA、spaP、prgH、mgtC、eutH、invG，用熒光定量PCR驗(yàn)證前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，結(jié)果顯示，在STM LT2 hfq基因缺失株轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中表現(xiàn)為對數(shù)期或穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因，在熒光定量PCR結(jié)果中也出現(xiàn)相同趨勢（表1）。表明前期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠，可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

表1 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR 驗(yàn)證結(jié)果Table 1 Results of the real-time PCR for differentially expressed genes

2.2 GO 富集細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程篩選Hfq 調(diào)控基因結(jié)果將分別在鼠傷寒hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因通過注釋GO terms 中的致病機(jī)制生物學(xué)過程。結(jié)果顯示，共篩選到28 個(gè)受hfq 基因缺失影響轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因，差異表達(dá)倍數(shù)均在2 倍以上，占鼠傷寒沙門菌致病機(jī)制生物學(xué)過程相關(guān)基因的35%。除hfq 基因外，共篩選到13 個(gè)基因ydiV、STM1583、sifB、rpoE、hilA、spaS、spaP、invI、invB、invA、invG、invF 和mgtC 在對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均表達(dá)上調(diào)（圖1），而穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平普遍高于對數(shù)期。表明Hfq 調(diào)控鼠傷寒沙門菌的致病機(jī)制，13 個(gè)致病機(jī)制相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的負(fù)調(diào)控。

圖1 細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.1 Expression of genes related to bacterial pathogenesis

2.3 Pathway 富集細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路篩選Hfq 調(diào)控基因結(jié)果將分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因通過注釋KEGG 數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路。結(jié)果顯示，總共篩選到95 個(gè)受hfq 基因缺失影響的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)基因，差異表達(dá)倍數(shù)均在2 倍以上，占鼠傷寒沙門菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)基因的52%，其中20 個(gè)基因STM1491、STM1492、STM1493、STM1494、STM1678、mppA、cbiO、cboQ、cbiM、ccmC、ccmB、ccmA、sitD、ugpB、pstC、pstS、malK、yabJ、potF 和ybjZ 在對數(shù)期和穩(wěn)定期均受到不同程度的影響（圖2）。其中在對數(shù)期和穩(wěn)定期中轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)趨勢相同的基因，均上調(diào)的有yabJ、ybjZ、cbiO、cboQ、cbiM、ccmC、ccmB、sitD和ccmA 基因，均下調(diào)的有ugpB 和malK 基因。以上結(jié)果表明，Hfq 調(diào)控鼠傷寒沙門菌的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，9 個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的負(fù)調(diào)控，2 個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的正調(diào)控。

圖2 細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.2 Expression of genes related to bacterial ABC transport pathway

2.4 Pathway 富集細(xì)菌群體感應(yīng)通路篩選Hfq 調(diào)控基因結(jié)果將分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因通過注釋KEGG 數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌群體感應(yīng)通路。結(jié)果顯示，共篩選到31 個(gè)受hfq 基因缺失影響的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)基因，差異表達(dá)倍數(shù)均在2 倍以上，占鼠傷寒沙門菌群體感應(yīng)通路相關(guān)基因的46%，其中有5 個(gè)基因yjeM、STM1678、yaeL、hfq 和mppA 在對數(shù)期和穩(wěn)定期均受到不同程度的影響（圖3）。除hfq 基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)均下調(diào)外，yjeM 和yaeL基因均上調(diào)。結(jié)果表明，Hfq 調(diào)控鼠傷寒沙門菌的群體感應(yīng)通路，2 個(gè)群體感應(yīng)通路相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的負(fù)調(diào)控。

圖3 細(xì)菌群體感相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.3 Expression of genes related to bacterial quorum sensing

3 討 論

關(guān)于細(xì)菌RNA 結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的研究正變得越來越重要。由于Hfq 普遍存在于各種細(xì)菌中，調(diào)控機(jī)理復(fù)雜且尚未研究透徹，篩選可能性最大的靶基因?qū)罄m(xù)鑒定成功率具有助推意義。本研究通過熒光定量PCR 對隨機(jī)挑選的6 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量的檢測，檢測結(jié)果與RNA-seq 結(jié)果相比，在表達(dá)量上存在一定差別，但這種差別是整體性的降低或升高，表明熒光定量PCR 檢測更加靈敏，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于轉(zhuǎn)錄組測序儀器的敏感性較低所致，而qRT-PCR檢測結(jié)果中各差異表達(dá)基因間的相對上調(diào)或下調(diào)趨勢與RNA-seq 結(jié)果完全相同，證明本次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，可用于進(jìn)一步的分析。

本研究分別從3 個(gè)方面篩選到除Hfq 外在兩個(gè)時(shí)期均出現(xiàn)差異表達(dá)的基因共37 個(gè)，細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程中除Hfq 表達(dá)下調(diào)外，其它13 個(gè)基因ydiV、STM1583、sifB、rpoE、hilA、spaS、spaP、invI、invB、invA、invG、invF 和mgtC 呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其中有一半以上基因參與沙門菌III 型分泌系統(tǒng)（T3SS）核心結(jié)構(gòu)-針狀復(fù)合體裝置蛋白和效應(yīng)蛋白的形成，主要由SPI-1 和SPI-2 基因編碼，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病原菌中的毒力蛋白輸出，由此推測Hfq 在正常情況下可能對STM LT2 III 型分泌系統(tǒng)（T3SS）相關(guān)毒力基因的表達(dá)活動(dòng)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，并且穩(wěn)定期表達(dá)量普遍高于對數(shù)期，這種情況不排除細(xì)菌處于對數(shù)生長期時(shí)優(yōu)越的環(huán)境及營養(yǎng)條件信號促使細(xì)菌抑制致病機(jī)制生物學(xué)活動(dòng)。也可能歸因于Hfq 在穩(wěn)定期細(xì)菌受外界環(huán)境壓力時(shí)受到抑制作用并且激發(fā)應(yīng)對外來干擾的機(jī)制[9]。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路中共篩選到20 個(gè)基因，其中有11個(gè)基因在兩個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)為統(tǒng)一上調(diào)或下調(diào)，均表達(dá)上調(diào)的有yabJ、ybjZ、cbiO、cboQ、cbiM、ccmC、ccmB、sitD 和ccmA 基因，其中值得關(guān)注的是參與細(xì)菌I 型細(xì)胞色素成熟系統(tǒng)（CCM）的基因ccmA、ccmB 和ccmC，它們執(zhí)行一種或多種對細(xì)菌生理學(xué)和生長至關(guān)重要的功能，包括鐵載體產(chǎn)生和利用，以及銅敏感性和錳氧化的改變等[10]，它們可能受到Hfq 的抑制作用，均下調(diào)的有ugpB 和malK基因，ugpB 在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)周質(zhì)空間中sn-甘油-3-磷酸（G3P）或甘油磷酸膽堿（GPC）分子的隔離，屬于ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)超家族成員[11]，malK 在鼠傷寒沙門菌中編碼麥芽糖ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與ATP 水解的亞基，Hfq 可能參與它們表達(dá)的正向調(diào)控。其余9 個(gè) 基 因potF、STM1491、STM1492、STM1493、STM1494、pstC 和pstS 先 上 調(diào) 后 下 調(diào)，STM1678 和mppA 基因先下調(diào)后上調(diào)，這種差異的產(chǎn)生懷疑受調(diào)控的因子不僅僅局限于Hfq 蛋白，Hfq 可能僅參與間接作用或不參與調(diào)控，這些基因可能在細(xì)菌響應(yīng)外界環(huán)境脅迫信號后通過其它機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。群體感應(yīng)通路中，篩選到4 個(gè)共表達(dá)基因，其中yjeM 和yaeL 基因均表現(xiàn)為上調(diào)，yjeM 是推定的APC 家族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，目前對其研究較少，在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)yaeL 編碼的蛋白酶能夠降解毒力激活劑TcpP 蛋白從而影響細(xì)菌毒力[12]。

此前有相關(guān)研究應(yīng)用高通量焦磷酸測序技術(shù)（HTPS）對STM LT2 hfq 基因缺失株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hfq 是一種影響近五分之一沙門菌基因表達(dá)的全局調(diào)節(jié)因子，缺失造成279 個(gè)基因上調(diào)，455 個(gè)基因下調(diào)[13]。與之對比，本研究篩選到的26 個(gè)可疑基因中有11 個(gè)基因ydiV、STM1583、mgtC、 cbiO、 cboQ、 cbiM、 ccmC、 ccmB、 ccmA、malK 和yjeM 未見其報(bào)道，產(chǎn)生這種差異的原因可能與測序平臺(tái)的選擇或篩選方式等其它因素有關(guān)[14]。11 個(gè)可疑基因中有5 個(gè)基因目前未見與Hfq 相關(guān)研究，包括編碼細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)蛋白為沙門菌在小鼠脾臟定植所需的STM1583 基因，存在于沙門菌SPI-2 毒力島；沙門菌在鎂缺乏培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞中存活起關(guān)鍵作用編碼Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mgtC 基因，由沙門菌SPI-3 毒力島攜帶[15]；與鈷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的cbiO 和cboQ 基因以及編碼推定的APC 家族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的yjeM 基因，5 個(gè)基因均參與沙門菌的毒力及生長活動(dòng)。

本研究對敲除hfq 基因的STM LT2 對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行再分析，從眾多差異表達(dá)基因中篩選到與細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程以及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路和群體感應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因26 個(gè)，它們分別在細(xì)菌對數(shù)期和穩(wěn)定期表現(xiàn)同一趨勢的上調(diào)或下調(diào)，并預(yù)測其受sRNA 伴侶蛋白Hfq 調(diào)控，為后期驗(yàn)證試驗(yàn)以及sRNA 伴侶蛋白Hfq 對鼠傷寒沙門菌調(diào)控機(jī)理的下游研究奠定基礎(chǔ)，并提供了參考數(shù)據(jù)。