一種檢測(cè)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量試劑盒的應(yīng)用評(píng)價(jià)

（深圳市龍崗區(qū)中心血站質(zhì)控科，廣東 深圳 518172）

輸血技術(shù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可缺少的重要治療手段，但存在經(jīng)輸血傳染的病毒性疾病的感染風(fēng)險(xiǎn)，因此，滅活血液中的病毒是臨床上保障輸血安全的重要措施之一[1]。當(dāng)前，為增加輸血安全性，減低臨床輸血病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，采供血機(jī)構(gòu)主要采用亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活血漿中的病毒[2]。亞甲藍(lán)滅活血漿的亞甲藍(lán)釋放量有效濃度為1.0～5.0 μmol，以保證有效滅活病毒；在滅活病毒以后，濾除亞甲藍(lán)需使用一次性病毒滅活過(guò)濾器，使亞甲藍(lán)最大殘留量不超過(guò)0.3 μmol/L（臨床用血漿的亞甲藍(lán)殘留量），以保證大劑量輸血后體內(nèi)亞甲藍(lán)的累積不會(huì)過(guò)多，從而確保用血安全[3]。亞甲藍(lán)殘留量是血站制備的血液成分病毒滅活血漿（亞甲藍(lán)光化學(xué)法）質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一[4]?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》（2019版）[5]介紹了采用自配試劑檢測(cè)亞甲藍(lán)殘留量的方法，但自配試劑存在標(biāo)準(zhǔn)品溯源性、冰乙酸（分析純）安全性、試劑配制耗時(shí)、試劑配制誤差等問(wèn)題。同時(shí)，規(guī)程規(guī)定其他經(jīng)驗(yàn)證可使用的方法亦可用于亞甲藍(lán)殘留量的檢測(cè)。本文通過(guò)對(duì)一種檢測(cè)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量試劑盒與自配試劑的比較分析，評(píng)估其可行性，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源：我站合格庫(kù)中抽取已冰凍的病毒滅活新鮮冰凍血漿和病毒滅活冰凍血漿各10袋。37 ℃水浴復(fù)溶后取樣15 mL，分成兩等份備用。

1.2 儀器與試劑：722G可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），亞甲藍(lán)（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），甲醇（廣東光華科技有限股份公司），冰乙酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），Water Oasis小柱（Waters Corporation Milford，Massachusetts USA），真空固相萃取裝置-隔膜真空泵（天津市津滕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），亞甲藍(lán)測(cè)定試劑盒（北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑盒操作步驟

1.3.1.1 亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品（0.5 μmol/L）：采用試劑盒配套的可追溯至企業(yè)工作標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)品。精密量取亞甲藍(lán)校準(zhǔn)品40 μL置于一試管內(nèi)，加未經(jīng)亞甲藍(lán)處理合格血漿360 μL混合后備用。

1.3.1.2 亞甲藍(lán)質(zhì)控品（0.3 μmol/L）：采用試劑盒配套的亞甲藍(lán)質(zhì)控品。精密量取亞甲藍(lán)質(zhì)控品40 μL置于一試管內(nèi)，加未經(jīng)亞甲藍(lán)處理合格血漿360 μL混合后備用。

1.3.1.3 樣品處理：固相萃取裝置上裝入3 mL SSH2P小柱數(shù)支，連接真空泵并檢查抽真空效果。用3 mL R1活化小柱。在其中兩只小柱中分別加入0.3 mL血漿亞甲藍(lán)校準(zhǔn)品和血漿亞甲藍(lán)質(zhì)控品，其余小柱中加入6 mL待測(cè)血漿。亞甲藍(lán)殘留量萃取后，用3 mL R2清洗，隨后用含2 mL R3洗脫。于3500 rpm離心洗脫液5 min，取上清液作為樣本溶液。

1.3.1.4 亞甲藍(lán)含量測(cè)定：用R3作試劑空白，各管吸光度在653 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算公式計(jì)算測(cè)試樣本亞甲藍(lán)殘留量。

1.3.2 自配試劑操作步驟：參照《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019版）附錄F.19亞甲藍(lán)殘留量。

1.3.2.1 亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)濃縮儲(chǔ)備液配制：精密稱(chēng)取亞甲藍(lán)對(duì)照品粉末38.0 mg，用蒸餾水溶解并稀釋至100 mL，配制成1.0 mmol/L的亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)濃縮儲(chǔ)備液，避光保存。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備：緊密量取1.0 mmol/L亞甲藍(lán)濃縮儲(chǔ)備液50 μL，置50 mL容量瓶中，用血漿稀釋至刻度，配成亞甲藍(lán)濃度為1.0 μmol/L的亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品。取3 mL固相提取柱，置于固相提取裝置上，取6 mL甲醇活化，加入6 mL標(biāo)準(zhǔn)品，提取亞甲藍(lán)；用30%甲醇6 mL清洗，之后用含1%乙酸的甲醇溶液6 mL洗脫，于3500 rpm離心洗脫液10 min，取上清液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2.3 樣品制備：取3 mL固相提取柱，置于固相提取裝置上，取6 mL甲醇活化，加入6 mL供試血漿，提取亞甲藍(lán)；用30%甲醇6 mL清洗，之后用含1%乙酸的甲醇溶液2 mL洗脫（樣本濃縮3倍），于3500 rpm離心洗脫液10 min，取上清液作為樣品溶液。

1.3.2.4 測(cè)定和計(jì)算：用含1%乙酸的甲醇溶液做試劑空白，在653 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)規(guī)程中的計(jì)算公式計(jì)算測(cè)試樣本亞甲藍(lán)殘留量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用±s表示，數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溯源性：見(jiàn)表1。

表1 兩種試劑標(biāo)準(zhǔn)品溯源性

2.2 安全性：冰乙酸（分析純）危險(xiǎn)性類(lèi)別屬于酸性腐蝕品。見(jiàn)表2。

表2 兩種試劑所用試劑

2.3 時(shí)限性：兩種試劑檢測(cè)每批次樣本耗時(shí)：試劑盒檢測(cè)每批次（10個(gè)樣本）需要0.5 h，自配試劑檢測(cè)每批次（10個(gè)樣本）需要1 h。見(jiàn)表3。

表3 兩種試劑檢測(cè)每批次樣本耗時(shí)

2.4 結(jié)果可比性：兩種試劑平行檢測(cè)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量測(cè)定結(jié)果：亞甲藍(lán)質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果均在控。兩種試劑平行檢測(cè)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量測(cè)定結(jié)果差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩種試劑亞甲藍(lán)殘留量測(cè)定結(jié)果（μmol/L）

3 討論

根據(jù)《獻(xiàn)血者健康檢查要求》（GB18467-2012）規(guī)定，獻(xiàn)血后血液檢測(cè)只局限于對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒（HIV）、梅毒（TP）進(jìn)行病毒檢測(cè)，不可能完全杜絕經(jīng)輸血傳播的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)[6]。亞甲藍(lán)能與病原微生物核酸和蛋白結(jié)合，在適當(dāng)波長(zhǎng)的熒光照射下，發(fā)生一系列化學(xué)或光生物效應(yīng)導(dǎo)致病原體失活達(dá)到滅活血液病毒的目的[7]。同時(shí)，一次性使用血漿病毒滅活器材能有效地去除血漿中殘存的白細(xì)胞，提高病毒滅活的安全性，能有效地控制病毒滅活血漿的安全性[8]，尤其是對(duì)脂包膜病毒的滅活效果很理想[9]。研究證明，亞甲藍(lán)光化學(xué)法能有效滅活血漿中多種脂質(zhì)包膜病毒以及尚未列入檢測(cè)的病毒[10-11]。亞甲藍(lán)光照法中亞甲藍(lán)的釋放量是決定病毒滅活程度的關(guān)鍵參量，亞甲藍(lán)釋放量過(guò)高，血漿中殘留量過(guò)大，易于導(dǎo)致累積毒性，而過(guò)低，又不能保證病毒滅活的效果。因此，需要對(duì)病毒滅活血漿中殘留的亞甲藍(lán)進(jìn)行檢測(cè)。亞甲藍(lán)的檢測(cè)方法有固相萃取-分光光度法、增敏熒光光譜法、高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、共振瑞利散射光譜法[12]?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》（2019版）采用固相萃取-分光光度法進(jìn)行病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量的檢測(cè)。但是在實(shí)際檢測(cè)工作中，規(guī)程采用的亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)項(xiàng)目的常規(guī)檢測(cè)方法操作工費(fèi)時(shí)[13]。采用自配試劑檢測(cè)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量，工作流程煩瑣，每次配制時(shí)由于工作人員、試劑、操作等原因造成的批間誤差也大[14]。血站質(zhì)量管理部門(mén)檢測(cè)結(jié)果直接反應(yīng)血液內(nèi)在質(zhì)量和血站采供血過(guò)程控制情況，直接影響采供血過(guò)程的糾偏效果[15]。在血液抽檢過(guò)程中嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將血液的每一步環(huán)節(jié)把握到位，才能保障血液安全[16-17]。試劑盒生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，按照GB/T21415-2008《體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測(cè)量校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的計(jì)量學(xué)溯源性》要求，試劑盒校準(zhǔn)品溯源至企業(yè)工作校準(zhǔn)品（由純品采用稱(chēng)量法賦值）。而自制試劑中的亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法溯源。試劑盒中包含的R1：甲醇，R2：30%甲醇，R3：1%乙酸甲醇三種試劑，均為無(wú)毒無(wú)害試劑。而配制1%乙酸甲醇溶液所用到的冰乙酸（分析純）危險(xiǎn)性類(lèi)別屬于酸性腐蝕品，存在生物安全隱患。試劑盒生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，試劑穩(wěn)定性為6個(gè)月。自配試劑的標(biāo)準(zhǔn)品、30%甲醇、1%乙酸甲醇需要進(jìn)行配置，而且配置后穩(wěn)定性難以評(píng)估，往往需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中現(xiàn)配先用，耗時(shí)，因而，在檢測(cè)每批次樣本時(shí)，試劑盒由于不需要進(jìn)行試劑的配制，要比自配試劑節(jié)省0.5 h。

從本文測(cè)定結(jié)果來(lái)看，兩種試劑平行檢測(cè)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量測(cè)定結(jié)果差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明試劑盒與《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019版）介紹的自配試劑在檢測(cè)病毒滅活亞甲藍(lán)殘留量上結(jié)果一致，符合其要求。

綜上，商品化試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品可溯源、安全、省時(shí)、結(jié)果準(zhǔn)確，可以用于病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘留量的檢測(cè)。