基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的陳山紅心杉EST-SSR 開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

陳興彬，何龍燕,2，肖復(fù)明，婁永峰，徐海寧，孫世武

（1. 江西省林業(yè)科學(xué)院 江西省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2． 廈門(mén)市江平生物基質(zhì)技術(shù)股份有限公司，福建 廈門(mén) 361000；3. 青原區(qū)白云山林場(chǎng)，江西 吉安 343000）

分子標(biāo)記是以DNA 序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，能在分子水平上反映個(gè)體間的差異。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）在真核生物基因組中分布廣泛，具有高度的多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記相比，SSR 標(biāo)記具有可靠性強(qiáng)、共顯性遺傳、信息含量高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，廣泛用于譜系地理學(xué)和遺傳多樣性分析等方面[1-2]。根據(jù)來(lái)源不同，SSR 標(biāo)記可分為基于基因組開(kāi)發(fā)的g-SSR 和基于表達(dá)序列標(biāo)簽開(kāi)發(fā)的EST-SSR，開(kāi)發(fā)g-SSR 操作繁瑣，難度高，效率低。EST-SSR 標(biāo)記源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，與gSSR 標(biāo)記相比，免去了文庫(kù)構(gòu)建，開(kāi)發(fā)時(shí)間短，無(wú)效等位基因頻率低，種間通用性更好[3-4]。同時(shí)，由于ESTSSR 是基因轉(zhuǎn)錄本的一部分，因此可作為功能基因直接鑒定的重要依據(jù)[5]。目前，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，火炬松Pinus taeda[6]、桉樹(shù)Eucalyptus[7-8]、橡膠樹(shù)Hevea brasiliensis[9]、日本落葉松Larix kaempferi[10]等樹(shù)種已開(kāi)發(fā)了大量多態(tài)性EST-SSR 標(biāo)記。

杉木Cunninghamia lanceolata是我國(guó)南方重要的速生用材樹(shù)種，廣泛分布于我國(guó)亞熱帶地區(qū)。由于長(zhǎng)期自然和人工選擇以及分布區(qū)內(nèi)氣候、土壤和地形地貌差異導(dǎo)致的生殖隔離等，杉木種源間存在顯著的遺傳差異。陳山紅心杉是具有江西地方特色的杉木優(yōu)良種源，其近髓心的木質(zhì)部為高比例的油亮的栗褐色，紅心香溢，材質(zhì)優(yōu)良，堅(jiān)韌耐腐[11]，是工藝建筑和室內(nèi)裝潢極為寶貴的天然材料，且在浙江、福建、四川等地栽植表現(xiàn)良好[12-13]。在杉木遺傳改良研究方面，各省區(qū)均開(kāi)展了各具特色的資源收集、種子園營(yíng)建、無(wú)性系篩選等工作，然而，杉木尚無(wú)全基因組序列信息，同時(shí)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)滯后，僅開(kāi)發(fā)出少量分子標(biāo)記[14-18]。分子標(biāo)記數(shù)量不足，嚴(yán)重制約了杉木基因定位、關(guān)聯(lián)分析等工作的開(kāi)展。本研究在分析陳山紅心杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記，旨在豐富可用于杉木遺傳分析的分子標(biāo)記數(shù)量，同時(shí)利用開(kāi)發(fā)的EST-SSR 標(biāo)記對(duì)陳山紅心杉二代種子園進(jìn)行遺傳變異評(píng)價(jià)，以便了解該種子園的遺傳基礎(chǔ)，為其高效管理提供參考信息。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以課題組培室培養(yǎng)的紅心杉優(yōu)良基因型C25作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的材料，隨機(jī)挑選3 株C25 組培苗，取頂端約2 cm 長(zhǎng)莖段進(jìn)行液氮速凍，隨后放到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

選取江西省安福縣武功山林場(chǎng)收集的5 個(gè)杉木種源（江西安福、湖南會(huì)同、廣西融水、浙江龍泉和福建建甌）的10 個(gè)杉木單株進(jìn)行引物初篩。SSR 群體擴(kuò)增所用材料取自江西省青原區(qū)白云山林場(chǎng)陳山紅心杉二代種子園，共計(jì)32 個(gè)無(wú)性系。取當(dāng)年生嫩葉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。采用改良的CTAB 法提取基因組總DNA。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

組培苗莖段在液氮中迅速研磨成粉末，等量混勻后提取總RNA。在Illumina HiSeq 2000 高通量測(cè)序平臺(tái)上對(duì)總RNA 進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序序列（reads）。采用Trinity 軟件對(duì)reads 進(jìn)行拼接，得到transcript 片段。利用Corset[19]進(jìn)行層次聚類(lèi)，得到unigene。

1.3 EST-SSR 挖掘和引物設(shè)計(jì)

采用MISA 軟件（http://pgrc.ipk- gatersleben.de/misa/）對(duì)unigene 序列中的1 ～6 核苷酸重復(fù)類(lèi)型SSR 位點(diǎn)進(jìn)行檢索，各重復(fù)序列長(zhǎng)度均≥18 bp，1 ～6 核苷酸類(lèi)型最小重復(fù)數(shù)分別為10、9、6、5、5 和 4 次。

隨機(jī)挑選150 個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)，用Primer3.0對(duì)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng) 度 為 18 ～ 25 bp；Tm 值 為 52.0 ～ 60.0 ℃，上下游引物Tm 值在5 ℃以?xún)?nèi)；（G+C）含量為40%～60%；引物擴(kuò)增長(zhǎng)度在100 ～300 bp 之間。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。

1.4 引物篩選與產(chǎn)物檢測(cè)

用合成的引物擴(kuò)增5 個(gè)杉木種源的10 個(gè)杉木DNA 樣品，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選多態(tài)性引物。PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同落葉松標(biāo)記開(kāi)發(fā)的相關(guān)方法[20]。對(duì)自行開(kāi)發(fā)得到的EST-SSR和檢索文獻(xiàn)得到的3 對(duì)SSR 標(biāo)記的正向序列進(jìn)行5′熒光修飾。用熒光修飾的引物對(duì)陳山紅心杉二代種子園32 個(gè)無(wú)性系基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。熒光修飾和毛細(xì)管電泳檢測(cè)交由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Gene Marker 2.2.0 軟件分析各毛細(xì)管電泳結(jié)果，得到各無(wú)性系的基因型數(shù)據(jù)；利用POPGENE version 1.32 軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon 多樣性指數(shù)（I）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）；由CERVUS3.0 軟件得出多態(tài)性信息含量（PIC）；采用NTSYS-pcV2.1[21]軟件計(jì)算無(wú)性系間的遺傳相似系數(shù)，選用UPGMA 法進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

紅心杉葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得99 122 394 個(gè)reads 片段，包含 14.87 Gb 序列信息，GC 含量平均值為43.40%，堿基Q30 為90.44%，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量非?？煽俊２捎肨rinity 拼接得到201 234個(gè)transcript 片段，序列信息為146 288 475 bp（146.29 Mb）， 平 均 長(zhǎng) 度 為 727 bp，N50 為1 270 bp。對(duì)不同長(zhǎng)度transcript 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，長(zhǎng)度為200 ～ 500 bp 的 transcript 最多，有 127 065 個(gè)，占總體的63.14%（表1）。對(duì)序列進(jìn)行組裝，共獲得76 597 個(gè)unigene，序列信息為104 182 562 bp（104.18 Mb），序列大小為201 ～17 690 bp，平均長(zhǎng)983 bp，N50 為1 963 bp，表明數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量較高。其中，≥1 000 bp 的unigene 最多，有37 687 個(gè)，占總體的49.20%；其次為500 ～1 000 bp的unigene，占總體的29.79%（表1）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組中 EST-SSR 位點(diǎn)的分布特點(diǎn)

對(duì)76 597 個(gè)unigene 進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索，共檢測(cè)到8 072 個(gè)SSR 位點(diǎn)，分布頻率（與總非重復(fù)序列數(shù)量之比）為10.54%，平均密度為12.88 kb。SSR 重復(fù)類(lèi)型豐富，各重復(fù)類(lèi)型所占比例變化較大（表2）。其中單核苷酸型位點(diǎn)最多，有5 352 個(gè)，占總數(shù)的66.30%，其次為三核苷酸類(lèi)型，為1 411個(gè)，占總數(shù)的17.48%，五核苷酸、六核苷酸類(lèi)型數(shù)量最少。2 ～6 核苷酸重復(fù)類(lèi)型和復(fù)合型的平均密度為38.30 kb，平均長(zhǎng)度分別為13.73、16.29、20.56、25.00、32.84 和 62.97 bp。2 720 個(gè) ESTSSR 位點(diǎn)中共包含250 種重復(fù)基序，復(fù)合型和四核苷酸類(lèi)型重復(fù)基序種類(lèi)最多，分別為159 和32個(gè)。AT/TA 重復(fù)基序出現(xiàn)頻率最高（548 次），占總EST-SSR 位點(diǎn)數(shù)的6.79%，其次是AG/TC（156次），占總EST-SSR 位點(diǎn)數(shù)的1.93%。AGA/TCT和AAG/TTC 是主要的三堿基重復(fù)序列，分別占總位點(diǎn)數(shù)的1.45%和1.44%。

表1 紅心杉轉(zhuǎn)錄組transcript 和unigene 數(shù)據(jù)組裝統(tǒng)計(jì)Table 1 Data assembly for transcript and unigene in the transcriptome of red-heart Chinese fir

表2 EST-SSR 重復(fù)基序的分布特征Table 2 Distribution of the SSR motifs in transcriptome of red-heart Chinese fir

2.3 EST-SSR 引物的篩選

以來(lái)自5 個(gè)種源的10 個(gè)杉木DNA 為模板擴(kuò)增隨機(jī)選擇的150 對(duì)SSR 引物，通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳共篩選出11 對(duì)與預(yù)期產(chǎn)物片段相符的多態(tài)性引物，圖1 為引物H8 的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。表3 列出了11 個(gè)多態(tài)SSR 引物的相關(guān)信息。

圖1 引物H8 在10 份杉木中的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 DNA fragments amplified by SSR primer H8 in 10 Chinese fir

2.4 陳山紅心杉二代種子園遺傳多樣性和遺傳相似系數(shù)

用篩選出11 個(gè)EST-SSR 標(biāo)記和來(lái)自文獻(xiàn)[13]的 3 個(gè) EST-SSR 標(biāo) 記（LX-13、LX-18、LX-55）對(duì)陳山紅心杉二代種子園32 個(gè)杉木無(wú)性系進(jìn)行遺傳多樣性分析（表4）。圖2 為引物H33 擴(kuò)增的熒光電泳圖。開(kāi)發(fā)的11 對(duì)引物中，有4 對(duì)引物的PIC 大于0.5，說(shuō)明這4 對(duì)引物為高信息含量的引物。14 對(duì)引物共擴(kuò)增得到62 個(gè)等位基因，等位基因范圍為3 ～7 個(gè)，平均等位基因數(shù)是4.4 個(gè)，其中，引物H245、LX-18 等位基因數(shù)最多，為7 個(gè)，H7、H8、H33、H193、LX-13 等位基因數(shù)最少，均為3 個(gè)。有效等位基因范圍為1.814 4 ～3.457 1，平均有效等位基因是2.4 個(gè)。位點(diǎn)多態(tài)信息含量（PIC）變動(dòng)幅度為0.373 0 ～0.660 0，平均為0.492 0。平均觀察雜合度和期望雜合度分別為0.533 5 和0.563 8，計(jì)算得出固定指數(shù)F為0.054，說(shuō)明存在純合子過(guò)量現(xiàn)象，但不明顯。Shannon 多樣性指數(shù)為1.003 4，說(shuō)明紅心杉二代種子園的遺傳多樣性較高。

遺傳相似系數(shù)分析表明，紅心杉二代種子園無(wú)性系間的遺傳相似系數(shù)變化范圍較大，在0.240 0～0.977 8 之間，平均值為0.589 3。無(wú)性系SS1 和SS25 遺傳相似系數(shù)最近，無(wú)性系SS9 和SS13 遺傳相似系數(shù)最遠(yuǎn)。依據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)紅心杉二代種子園無(wú)性系群體進(jìn)行聚類(lèi)分析，在閾值0.62處可將32 個(gè)無(wú)性系劃分為6 個(gè)亞群體（圖3），亞群體內(nèi)個(gè)體數(shù)量差異較大，無(wú)性系最多的亞群包含21 個(gè)無(wú)性系，無(wú)性系SS9 和SS10 單獨(dú)成群，與其它群無(wú)性系親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 紅心杉11 對(duì)EST-SSR 的引物序列、重復(fù)基序、片段大小和退火溫度Table 3 The sequence of forward and reverse primers, repeat motif, expected size and annealing temperature of the 11 EST-SSR developed in red-heart Chinese fir

圖2 引物H76 在紅心杉二代種子園無(wú)性系個(gè)體中的熒光電泳Fig. 2 Fluorescence electrophoresis by H76 in two clones of the second generation orchard of red-heart Chinese fir

表4 紅心杉二代種子園遺傳多樣性的SSR 分析Table 4 Genetic diversity estimates for the second generation orchard of red-heart Chinese fir by SSR markers

圖3 基于遺傳距離的紅心杉二代種子園無(wú)性系的聚類(lèi)Fig. 3 A dendrogram of based on gentic distance for the second generation orchard clones of red-heart Chinese fir

3 結(jié)論和討論

3.1 陳山紅心杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量和EST-SSR 的分布特點(diǎn)

Illumina 高通量測(cè)序適合于沒(méi)有參考基因組的物種展開(kāi)轉(zhuǎn)錄組研究[22]，Q30 值是測(cè)序質(zhì)量的指標(biāo)，Q30 在80%以上就認(rèn)為測(cè)序質(zhì)量非?？煽縖23]，N50 值反映組裝質(zhì)量，N50 越大說(shuō)明組裝得到的長(zhǎng)片段就越多，組裝效果就越好[24]。本研究通過(guò)Illumina 高通量測(cè)序得到14.87 Gb 序列信息，GC 含量平均值為43.40%，堿基Q30 為90.44%，組裝得到76 597 個(gè)unigene，unigene 平均長(zhǎng)度為983 bp，N50 為1 963 bp。說(shuō)明此次測(cè)序的質(zhì)量和組裝的質(zhì)量均較高，可以滿(mǎn)足轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的要求。

從陳山紅心杉76 597 個(gè)unigene 中共檢測(cè)到8 072 個(gè) SSR 位點(diǎn)，2 ～ 6 核苷酸重復(fù)類(lèi)型 SSR 位點(diǎn)分布頻率為3.28%，平均密度為41.47 kb。就SSR位點(diǎn)分布頻率而言，紅心杉與火炬松（4.32%）[25]、馬尾松Pinus massoniana（3.62%）[26]、紅松Pinus koraiensis（4.24%）[27]和日本落葉松（3.58%）[20]相當(dāng)，但小于楊樹(shù)Populus的SSR 位點(diǎn)分布頻率（14.83%）[28]。物種差異、數(shù)據(jù)庫(kù)大小、SSR 搜索條件及組織處理方式等均會(huì)對(duì)SSR 分布頻率和分布密度產(chǎn)生影響[29]，為客觀地比較不同轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，亟需統(tǒng)一SSR 搜索條件。紅心杉轉(zhuǎn)錄組中，除單核苷酸重復(fù)外，以三核苷酸重復(fù)最多，占SSR 總數(shù)的17.48%。在榧樹(shù)Torreya grandis[30]、桉樹(shù)[31]等的研究中，也發(fā)現(xiàn)三核苷酸重復(fù)比重最大，這可能與密碼子的選擇性有關(guān)。而茶樹(shù)Camellia sinensis[32]、云南金花茶Camellia fascicularisH.T.Chang[33]、橡膠樹(shù)[34]等則以二核苷酸重復(fù)最多。因此，為提高引物篩選效率，在設(shè)計(jì)SSR 引物時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)設(shè)計(jì)出現(xiàn)頻率較高的重復(fù)類(lèi)型。本研究還發(fā)現(xiàn)重復(fù)基序類(lèi)型AT/TA 的SSR位點(diǎn)最多，同樣的在干旱脅迫處理的杉木轉(zhuǎn)錄組中，占主導(dǎo)到位的也是AT/TA 類(lèi)型（占總ESTSSR 的19.01%）[16]，說(shuō)明SSR 位點(diǎn)基序類(lèi)型具有物種特異性。

3.2 陳山紅心杉二代種子園遺傳多樣性

本研究基于多個(gè)杉木地理種源樣本篩選出的11 對(duì)多態(tài)性EST-SSR，可用于不同產(chǎn)區(qū)杉木的分子遺傳分析。其中4 對(duì)引物的PIC 大于0.5，為高信息含量的引物。紅心杉二代種子園的觀察雜合度、期望雜合度和Shannon 多樣性指數(shù)分別為0.533 5、0.563 8 和1.003 4，高于華北落葉松[35]一代無(wú)性系種子園的Shannon 多樣性指數(shù)0.712 7 和馬尾松[36]二代無(wú)性系種子園的Shannon 多樣性指數(shù)0.850。在杉木的遺傳多樣性研究中，歐陽(yáng)磊等[37]研究表明國(guó)家級(jí)杉木種質(zhì)資源庫(kù)第1 代種質(zhì)資源的觀察雜合度為0.430 0，Shannon 信息指數(shù)為0.980 0；徐陽(yáng)等[38]研究得出42 個(gè)杉木種源的觀測(cè)雜合度為0.284 5，Shannon 信息指數(shù)為0.518 2，均低于本研究結(jié)果，但略低于Duan 等[39-40]對(duì)廣西149 個(gè)紅心杉單株和6 個(gè)杉木種源700 個(gè)無(wú)性系的遺傳多樣性研究。其觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為0.562 0 和0.584 0，0.561 和0.604，這可能與其分析個(gè)體數(shù)量較多有關(guān)。因此，陳山紅心杉二代種子園遺傳多樣性相對(duì)較高，具有較大的育種潛力。

經(jīng)檢測(cè)紅心杉二代種子園無(wú)性系之間遺傳相似系數(shù)在0.240 0 ～0.977 8 之間，說(shuō)明這一群體有較寬的遺傳基礎(chǔ)，在遺傳相似系數(shù)0.62 處可將32 個(gè)無(wú)性系劃分為6 個(gè)亞群體。通過(guò)分子標(biāo)記明確種子園無(wú)性系間的親緣關(guān)系，并結(jié)合無(wú)性系的表型性狀，可為無(wú)性系間的雜交育種、新建種子園無(wú)性系間的科學(xué)配置提供依據(jù)。

本研究利用陳山紅心杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)ESTSSR標(biāo)記，共獲得11個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好的標(biāo)記，豐富了杉木分子標(biāo)記庫(kù)，可用于杉木種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及分子標(biāo)記輔助育種等方面。利用SSR 標(biāo)記對(duì)陳山紅心杉二代種子園的遺傳多樣性分析表明，該種子園遺傳多樣性較高，遺傳基礎(chǔ)較寬，具有產(chǎn)生優(yōu)良子代的潛力。雖然SSR 標(biāo)記具有可靠性強(qiáng)、共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但也存在引物設(shè)計(jì)篩選費(fèi)時(shí)、篩選成功率低（本研究為7.3%）、標(biāo)記數(shù)量有限等缺點(diǎn)，難以滿(mǎn)足短期內(nèi)區(qū)分大量樣本的需要。SNP 是第3 代分子標(biāo)記，與SSR 標(biāo)記相比，具有數(shù)量更多、分布更廣泛、遺傳穩(wěn)定性更高、易于快速高通量進(jìn)行基因分型等優(yōu)點(diǎn)。隨著SNP 標(biāo)記檢測(cè)成本的逐漸降低，高通量的SNP 標(biāo)記在群體擴(kuò)增、遺傳圖譜構(gòu)建方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。因此，開(kāi)發(fā)合適的SNP 標(biāo)記可作為今后杉木分子標(biāo)記研究的重點(diǎn)。