高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性研究

趙曉麗，岳薇薇，苗文清，錢 凈，朱 丹，李穗雯，楊悅林，黎海生，胡大春

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650011）

原發(fā)性高血壓是最常見的危害人體健康的心血管疾病，是在遺傳易感的基礎(chǔ)上，多種環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。2018 年《中國(guó)高血壓防治指南》指出[1]。心腦血管疾病死亡占總死亡人數(shù)的40%以上，其中高血壓是心腦血管病發(fā)病的第一危險(xiǎn)因素。高血壓病的病因病理機(jī)制復(fù)雜，其中鈉肽家族及其受體起著舉足輕重的作用[2-3]。前人及筆者前期的研究均發(fā)現(xiàn)高血壓患者存在NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性，并影響高血壓病的發(fā)生，但其在病理機(jī)制中的作用并不清楚。NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)處于基因表達(dá)調(diào)控區(qū)，推測(cè)該位點(diǎn)多態(tài)性有可能影響NPR-C 的表達(dá)，進(jìn)而影響其對(duì)配體ANP 的清除，或影響NPR-C 及其配體結(jié)合后的信號(hào)通路。為此，本研究試圖通過對(duì)高血壓病患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性與外周血調(diào)節(jié)血壓相關(guān)因素的分析，對(duì)上述假設(shè)給予證實(shí)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 高血壓患者的納入標(biāo)準(zhǔn)（1） 云南漢族的界定：父系、母系三代均為漢族，均居住云南境內(nèi)；（2） 高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2018 年《中國(guó)高血壓防治指南》[1]，用以下標(biāo)準(zhǔn)篩選:在未使用降壓藥物的情況下，非同日3 次測(cè)量血壓，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa） 和/或舒張壓≥90 mmHg；患者既往有高血壓史，現(xiàn)正在服抗高血壓藥，雖血壓＜140/90 mmHg，仍診斷為高血壓；家庭血壓≥135/85 mmHg；動(dòng)態(tài)血壓白天平均值≥135/85 mmHg，或24 h 平均值≥130/80 mmHg 診斷為高血壓；（3） 高血壓患者的年齡在40～80 歲之間；（4） 研究對(duì)象個(gè)體間無(wú)血緣關(guān)系。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 有臨床或?qū)嶒?yàn)室信息提示為繼發(fā)性高血壓者。

1.1.3 研究對(duì)象剔除標(biāo)準(zhǔn)（1） 研究對(duì)象的民族界定不清或基本特征指標(biāo)信息不清者；（2） 觀察指標(biāo)檢測(cè)失敗者。

1.1.4 研究對(duì)象的來(lái)源 2018 年1 月至6 月選取在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院健康體檢、門診和住院就診中發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性高血壓患者100 例。其中男性48 例，女性52 例；高血壓合并冠心病者64例，高血壓未合并冠心病者36 例；高血壓合并糖尿病者25 例，高血壓未合并糖尿病者75 例。

1.1.5 倫理學(xué)措施 本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者已填寫知情同意書。

1.2 樣本采集與保存

采用含EDTAK2 采血管，經(jīng)肘靜脈采集空腹靜脈血2 mL，采血后立即顛倒混勻并標(biāo)記，將標(biāo)記好的標(biāo)本置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

PCR 反應(yīng)試劑、FastDigest CseI、溴酚藍(lán)為Fermentas 公司產(chǎn)品；DNA Marker # DL500 為Takara 公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Santaibio 公司產(chǎn)品；TAE 緩沖液為上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DNA 提取液為廣州中山達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠為上海聯(lián)邁生物工程有限公司產(chǎn)品；引物由生工生物工程（上海） 有限公司合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

Gel Doc 2000TM 凝膠成像分析系統(tǒng)、MyCycler，Bio-RadPCR 擴(kuò)增儀；Heraeus 低溫高速離心機(jī)；Milipore 超純水機(jī)；Power PAC 3000 電泳儀；電熱恒溫水浴箱；漩渦振蕩器。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 基因組DNA 的提取 根據(jù)試劑說明書使用血液基因組DNA 提取試劑盒快速提取基因組DNA。

1.5.2 引物序列 NPR-C 基因A-55C 引物序列引用文獻(xiàn)[4]中的引物，由生工生物工程（上海） 有限公司合成。

NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)引物序列如下：

F（5'-3'）：CACCGTCAATTACAAACACTTGGA CAAGTCTAAC

R（5'-3'）：CACCCTTCCTCTTTCCTCCCCACT CTTCTCTCCA

1.5.3 目的片段PCR 反應(yīng)體系和條件 PCR 反應(yīng)體系：總體積50 μL，含DNA 模板3 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，DreamTaq Green PCR Master Mix（2X） 25 μL，無(wú)核酸酶水，21 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min，96℃變性50 s，58℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。

1.5.4 目的片段PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物HgaI 酶切反應(yīng)體系 采用PCR-RFLP 法對(duì)目的片段PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，反應(yīng)體系為：無(wú)核酸酶水1.5 μL，10×快速限制性內(nèi)切酶緩沖液2 μL，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL，HgaI 酶1.5 μL。將上述體系混勻，離心機(jī)快速離心10 s，使反應(yīng)體系集中，然后37℃水浴30 min進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物酶切。

1.5.5 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物分析配制1.5%的瓊脂糖凝膠，電壓120 V，電泳45 min，取20 μL 酶切產(chǎn)物點(diǎn)樣，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。根據(jù)HgaI 酶切片段的數(shù)量與長(zhǎng)度不同，判斷基因型：酶切產(chǎn)物出現(xiàn)105 bp、265 bp 兩個(gè)片段者判為AA 純合型；出現(xiàn)88 bp、105 bp、177 bp 3 個(gè)片段者判為CC 純合型；出現(xiàn)88 bp、105 bp、177 bp、265 bp 4 個(gè)片段者判為AC 雜合型。

1.6 質(zhì)量控制

所有觀察指標(biāo)的檢測(cè)均參加國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，成績(jī)優(yōu)秀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)基因型和等位基因頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)，當(dāng)P＞0.05 時(shí)，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來(lái)自同一蒙德爾群體。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

100 例云南漢族原發(fā)性高血壓患者樣本NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示：100 例樣本中未檢出AA 基因型，檢出AC 和CC 基因型，其中AC 基因型25 例，CC 基因型75 例。部分患者目的片段PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物及其酶切片段電泳結(jié)果見圖1。

圖1 基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Test results of gene polymorphism

2.2 原發(fā)性高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布

100 例云南漢族高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布見表1。結(jié)果顯示研究對(duì)象中CC 基因型頻率是AC 基因型頻率的3 倍，C 等位基因頻率是A 等位基因頻率的7倍。各基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P=0.153）。

3 討論

原發(fā)性高血壓的病理機(jī)制十分復(fù)雜。長(zhǎng)期血壓升高極易引發(fā)患者心、腦、腎、大血管等諸多靶器官出現(xiàn)相應(yīng)病理改變，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的心、腦、腎等器官并發(fā)癥[5]。但目前高血壓病尚無(wú)治愈措施，臨床主要為對(duì)癥治療。探索原發(fā)性高血壓的病因病理機(jī)制對(duì)治療和預(yù)防該病有十分重要的意義。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性在原發(fā)性高血壓中的病理機(jī)制中的作用，為闡明原發(fā)性高血壓病因病理機(jī)制提供線索。

表1 高血壓病患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布［n（%）］Tab.1 The genotypic and allelic distributions of A-55C of NPR-CGene in essential hypertension［n（%）］

國(guó)內(nèi)外有較多有關(guān)NPR-C 基因位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓易感性的相關(guān)研究報(bào)道[6-8]。Ehret G B等人[9]對(duì)20 萬(wàn)歐洲人進(jìn)行關(guān)于血壓的全基因組關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)NPR3 基因3，側(cè)翼序列rs1173771 位點(diǎn)多態(tài)性與歐洲人原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)。Kato等[10]通過對(duì)19 608 名具有東亞血統(tǒng)的受試者收縮壓和舒張壓的全基因組關(guān)聯(lián)研究進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)NPR-C 基因rs1173766 位點(diǎn)多態(tài)性與東亞和日本人群高血壓病易感性相關(guān)。Sarzani R 等[4]對(duì)84 例患原發(fā)性高血壓的高加索人進(jìn)行研究得出NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)的基因型頻率為AA（0.035）、AC（0.297）、CC（0.668）。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在歐洲人NPR3-C5orf23（rs1173771） 與高血壓易感性相關(guān)[11]。筆者先前用DNA 雜交芯片技術(shù)對(duì)100 例云南漢族原發(fā)性高血壓患者和97 例健康人進(jìn)行了NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果顯示CC 基因型增加了原發(fā)性高血壓的易感性，其OR值達(dá)3.77[12]。本次研究采用RFLP-PCR 法測(cè)定了100 例云南漢族原發(fā)性高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性，結(jié)果顯示原發(fā)性高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)基因型頻率分別為AA（0）、AC（0.25）、CC（0.75）；NPR-C 基因A-55C位點(diǎn)等位基因頻率為A（0.125）、C（0.875），兩次分別檢測(cè)不同的100 例云南漢族原發(fā)性高血壓患者該位點(diǎn)基因多態(tài)性都沒有檢測(cè)到AA 基因型，提示NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性存在種族差異，但兩次研究結(jié)果均可提示CC 基因型與原發(fā)性高血壓易感有關(guān)，并與Sarzani R 等[4]的結(jié)果相似。

綜上所述，較多研究提示NPR-C 基因多態(tài)性可能參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展[13-15]，但迄今鮮見關(guān)于NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)多態(tài)性在原發(fā)性高血壓病理機(jī)制中作用的研究報(bào)道。本研究結(jié)果提示NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)CC 基因型與原發(fā)性高血壓易感相關(guān)，上述結(jié)果為NPR-C 基因A-55C 位點(diǎn)突變?cè)谠l(fā)性高血壓中的遺傳病理機(jī)制的研究提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。今后我們課題組會(huì)在這方面做更深一步的研究。