c-Myc、hTERC 基因檢測及HC2-HPV 分子檢測對宮頸癌前病變的診斷價值

廖 婧，許長俊，周紅林，劉 洋

（1） 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦科，云南昆明 650101；2） 玉溪市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科，云南玉溪 653100；3） 昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，云南昆明 650101）

宮頸癌（cervical cancer，CC） 是發(fā)展中國家婦女患病率最高的生殖道惡性腫瘤，我國每年新增確診人數(shù)超過13 萬，為全球患病人數(shù)的28.2%[1]。大樣本數(shù)據(jù)證實，幾乎所有CC 和絕大多數(shù)宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） 患者中均可發(fā)現(xiàn)HPV 感染[2]，高危型HPV 持續(xù)感染者首先出現(xiàn)CIN，其需要10 a 及以上演變至CC，因此國內(nèi)外專家一致認為高危型HPV 的持續(xù)感染是CC 及CIN 的高危因素。目前HC2 HPV檢測法是被世衛(wèi)組織公認的可用于臨床的HPV 檢測技術，其已被推廣使用于世界各國。但由于CC及CIN 的發(fā)病率遠低于HPV 的高感染率（70%～80%）[3]，提示除HPV 感染外還有其他因素影響CC 的發(fā)生和進展，如基因的調(diào)控[4]等。有學者發(fā)現(xiàn)，c-Myc 基因是位于染色體8q34 上的一個癌基因，其在細胞增值、分化和凋亡等發(fā)揮至關重要的作用。已證實該基因的過度擴增與乳癌、膽囊癌、胃腸道腫瘤等多種實體惡性腫瘤的發(fā)展預后息息相關，其可能也是宮頸癌的一種潛在標志物[5]。而hTERT 做為端粒酶的催化劑，其通過決定端粒酶活性以影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移。據(jù)相關文獻報道，hTERT 的高表達與90%惡性腫瘤均有密切聯(lián)系[6]，其中也包括宮頸癌。本研究以組織病理診斷為金標準，應用FISH 技術和雜交捕獲技術分別檢測不同宮頸組織中c-Myc 基因、hTERT 基因與HPV 等生物標志物，旨在探究其與CC 發(fā)生發(fā)展的關聯(lián)性，以及c-Myc 基因、hTERT 基因對篩檢CC 的應用價值，為CC 的防治提供更全面高效的臨床思路和篩查策略。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為1 200 名于昆明醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科就診且行宮頸篩查的患者，入選條件為有性生活且已排除妊娠可能、既往未行陰道鏡檢查、宮頸活檢及宮頸局部治療等，分別行HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 檢測，任意一項結果異常者（150例） 行宮頸活檢術，以組織病理學為金標準進行分組，其中正常組32 例，CIN 組104 例（包括CINI38 例，CINII/CINIII66 例），CC 組14 例。本研究已通過醫(yī)院倫理審查委員會審查。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及實驗步驟 取得患者知情同意后，借助陰窺器顯露宮頸，于宮頸鱗-柱交界區(qū)域用指定的樣本采集刷旋轉3～5 圈，后置于保存液內(nèi)，標記后送檢。HC2 技術依照相關試劑盒操作指南完成。FISH 技術亦嚴格遵照FISH 探針（由北京金菩嘉提供） 操作指南進行檢測。

1.2.2 結果判讀標準 選擇符合條件的100 個細胞計數(shù)，即具有完整的細胞核形態(tài)且強雜交信號。被特異性探針標記者表現(xiàn)為紅色、綠色熒光。陽性判斷標準:c-Myc 基因：細胞核內(nèi)出現(xiàn)多于2 個特定熒光標記者為異常細胞。若異常細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)≥指定數(shù)值，則代表c-Myc 基因陽性，其擴增異常。hTERT 基因的陽性判斷標準同前。HC2-HPV 的結果判讀：≥1.0 pg/mL（≥5 000 copies/mL） 為陽性，＜1.0 pg/mL 則為陰性[7]。

1.3 統(tǒng)計學處理

本實驗的相關數(shù)據(jù)采用SPSS 分析，通過繪制受試者工作曲線（receiver operator characteristic curves，ROC） 來分析c-Myc 基因、hTERC 基因及HC2-HPV 分子檢測單獨檢測宮頸癌前病變的效能。計數(shù)資料采用卡方檢驗和Spearman 相關性檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HC2 -HPV、c-Myc 基因、hTERT 基因檢測結果與病理學診斷結果對比

因HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因檢測中任意一項結果有異者行陰道鏡下活檢，共150 例，其中正常組32 例，CIN I 38 例，CIN II/CIN III 66例，CC 組14 例。對上述病理學結果與其HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因結果對比發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變的加重，HC2-HPV 感染率、c-Myc 和hTERT 基因表達率均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 宮頸病變與HC2 -HPV 感染、c-Myc 及hTERT 基因表達的相關性分析［n（%）］Tab.1 Correlation analysis of cervical lesions with HC2 -HPV infection,c-myc and hTERT gene expression［n（%）］

2.2 HC2 -HPV、c-Myc 和hTERT 基因篩檢宮頸病變的ROC 曲線分析

HC2－HPV 法單獨預測宮頸病變的AUC 為0.699（95%CI:0.613～0.785，P=0.000），靈敏度為91.3%，特異度為48.6%。c-Myc 基因檢測法單獨篩檢宮頸病變的AUC 為0.677（95%CI:0.59～0.763，P=0.000），靈敏度為62.5%，特異度為72.9%。hTERT 基因檢測法單獨篩檢宮頸病變的AUC 為0.687（95%CI:0.601～0.772，P=0.000），靈敏度為58.8%，特異度為78.6%，見圖1。

2.3 c-Myc 基因、hTERT 基因表達與HC2-HPV感染在宮頸病變中的關系

隨著宮頸病變程度的升級，c-Myc 基因和hTERT 基因的擴增表達率和HC2-HPV 感染率均有不同程度的上升，且c-Myc 和hTERT 兩種基因的表達與HC2-HPV 感染率之間呈正相關（r1=0.576，P=0.000；r2=0.545，P=0.000），見表2。

圖1 HC2 -HPV、c-Myc 和hTERT 基因單獨篩檢宮頸病變的ROC 曲線圖Fig.1 ROC curves of HC2-HPV,C-MYC and hTERT genes for screening cervical lesions separately

表2 HC2-HPV 陽性、c-Myc 基因陽性及hTERT 基因陽性之間的相關性分析［n（%）］Tab.2 The correlation between the positive result of HC2-HPV,C-MYC and hTERT［n（%）］

3 討論

CC 的發(fā)病人群日益年輕化，但疾病發(fā)展卻十分緩慢，從最初的CIN 發(fā)展至CC 約10～20a，因此早期、及時的診斷和治療顯得尤其重要[8]，現(xiàn)可明確高危型HPV 感染系導致宮頸病變的首要因素，因此及時檢測HPV 對于防治CC 具有重要意義。HC2 檢測技術是最早被美國、歐洲和中國等多個國家認可并被建議作為HPV 檢測的金標準[9]，因為其可在分子水平對13 種高危型HPV 進行HPV-DNA 定性測量（≥1.0 ng/L 即為陽性）。本研究結果顯示，與基因檢測對比，HC2 技術檢測HPV 感染對評估宮頸病變具有較高的靈敏度（91.3%），可顯著降低CIN 及CC 漏診率，這與Yin[10]的文章數(shù)據(jù)相一致，但特異度較低，存在一定的誤診幾率，不可避免會增加患者的心理焦慮及經(jīng)濟負擔。因此僅憑HC2-HPV 陽性無法準確判斷和評估宮頸病變的嚴重程度，其在臨床中篩查宮頸病變并不全面，需要新的生物標志物來協(xié)同判斷和評估疾病的嚴重程度。

c-Myc 基因作為癌基因家族的成員之一，因其通過調(diào)控細胞的增殖與凋亡使惡性腫瘤細胞無限增殖，被證實與前列腺癌、胃癌、肝癌等多種實體惡性腫瘤的發(fā)生有極強的關聯(lián)性。近年來多位婦瘤專家與學者也已證實[11]，c-Myc 基因過度表達的患者發(fā)生CC 及CIN 的可能性較高，c-Myc 基因或許可成為CC 的特異性診斷指標。本研究數(shù)據(jù)示，CC 和CIN 組中c-Myc 基因表達擴增率顯著高于正常組，提示c-Myc 在CC 和CIN 中過度表達，這與盧建軍[12]的結論相一致。基于基因檢測技術水平，C-myc 基因的特異度較高，且其與高危型HPV 感染情況密切相關，提示c-Myc 基因檢測可以與HC2 法聯(lián)合作為宮頸病變嚴重程度的預測標準，提高疾病診斷的準確性。

hTERT 基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的生物標記物，研究提示它的擴增率會隨著宮頸病變級別的增高而增加[13]。作為端粒酶的催化亞基，它的擴增表達情況可影響染色體端粒的長度以使細胞永生化，使腫瘤細胞獲得無限生長進化的優(yōu)勢[14]，其對包括CC 在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展十分關鍵。本研究表明，hTERT 基因在宮頸正常組、CINI 組、CIN II-III 組、CC 組中的表達率分別為12.50%、34.21%、53.03%、85.71% （χ2=28.9，P=0.000）。提示hTERT 基因擴增表達率隨宮頸病變的升級而升高，且正常組與CINI 組明顯低于CIN II-III 組與CC 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與陳露露等人[15]結論相似。與常用的HC2-HPV 法相比，通過FISH 技術測定hTERT 基因具有特異性高、準確性較好的優(yōu)點，單獨檢測該基因對宮頸癌診斷有一定的價值，但是聯(lián)合其他標志物（如HPV、c-Myc 基因等） 檢測將更有意義，能提高CC 及CIN 診斷的敏銳性和準確性[16]。

綜上所述，本文論述了HC2-HPV、c-Myc 和hTERT 基因檢查在篩檢宮頸病變中的應用價值，條件允許者建議聯(lián)合篩查，可顯著提升宮頸疾病診斷的靈敏性和特異性，具有可觀的診斷應用前景。不僅如此，基于對上述兩種基因的深入探究和摸索，現(xiàn)已有相關基因靶向藥物或酶抑制劑[17-18]處于研發(fā)試驗階段。相信隨著醫(yī)學科技不斷進步和發(fā)展，c-Myc 和hTERT 基因在宮頸癌的診治方面會有更大的利用價值。