山東省小麥白粉病菌群體毒性鑒定和分析

張眉，郭霞，辛志梅，王升吉，辛相啟，姜珊珊，吳斌

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所／山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

小麥?zhǔn)巧綎|省主要糧食作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)極大關(guān)系著糧食安全［1］。小麥白粉病是小麥的主要病害之一，多以病菌孢子隨氣流傳播，具有流行速度快、危害范圍廣、控制難度大等特點(diǎn)。近年來發(fā)生頻繁，危害損失嚴(yán)重，已逐漸成為限制小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要因素之一，嚴(yán)重威脅著小麥的安全生產(chǎn)［2，3］。在眾多防治措施中，選育和應(yīng)用優(yōu)質(zhì)、抗病品種是防治小麥白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。由于小麥白粉病菌具有高度變異性，不同地區(qū)之間的群體結(jié)構(gòu)存在差異，因此加強(qiáng)小麥白粉病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究、充分利用抗病品種的有效性，可有效降低白粉病對小麥產(chǎn)量帶來的不利影響［4，5］。

目前國內(nèi)外普遍采用一套已知抗性基因品種（系）進(jìn)行小麥白粉病菌群體毒性結(jié)構(gòu)監(jiān)測。Parks［6］和EI-Shamy［7］等分別于2008年和2016年應(yīng)用已知抗白粉病基因材料監(jiān)測了2003—2005年美國東南部和2013—2014年埃及小麥白粉病菌的群體毒性結(jié)構(gòu)。該技術(shù)從20世紀(jì)80年代開始，逐漸應(yīng)用于我國部分省（市）小麥白粉病菌群體的毒性監(jiān)測研究中，近幾年來很多研究者采用該方法對陜西、河南、新疆、四川、山東、甘肅、黑龍江［5，8-13］等小麥主要產(chǎn)區(qū)白粉病菌的毒性結(jié)構(gòu)開展大量研究，基本明確了各地小麥白粉病菌的毒性基因頻率和有效抗病基因組成。

小麥白粉病菌的毒性頻率是動(dòng)態(tài)變化的，因此本研究采用鑒別寄主毒性監(jiān)測方法［14］，對2018年山東省不同地區(qū)小麥白粉病菌的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行毒性鑒定和分析，并與2015年對山東省小麥白粉病菌的毒性監(jiān)測結(jié)果［11］做比較，旨在為山東省推廣抗病品種及品種合理布局提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：于2018年5—6月小麥白粉病高發(fā)期，在山東省德州、煙臺、濟(jì)南、濟(jì)寧、聊城、臨沂6市共16個(gè)地點(diǎn)采集小麥白粉病葉（表1），自然晾干后，每片病葉隔離放置并于4℃保存。

鑒別寄主：共31個(gè)小麥品種，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；濟(jì)南15為當(dāng)?shù)仄贩N，作為感病對照（表2）。小麥白粉病菌的分離、純化和擴(kuò)繁均采用濟(jì)南15。

表1 小麥白粉病菌供試菌株信息

1.2 小麥白粉病菌的毒性鑒定

將保存于4℃的小麥白粉病葉浸泡于清水中，使休眠的閉囊殼萌發(fā)。挑取萌發(fā)好的閉囊殼至噴濕小麥葉片的霧滴中，罩上帶6層紗布的玻璃罩使其在16～20℃溫度下隔離保濕培養(yǎng)。剪下有單孢子萌發(fā)的葉片，掃涂于1葉1心期的濟(jì)南15麥苗上隔離保濕培養(yǎng)，即形成單孢子菌源，擴(kuò)繁一次備用，總共得到62株單孢子堆菌株。

利用31個(gè)已知抗病基因的鑒別寄主和1個(gè)感病對照（濟(jì)南15）對所有供試菌株進(jìn)行毒性鑒定，分別將擴(kuò)繁好的小麥白粉病菌掃涂于鑒別寄主苗上，每個(gè)菌株兩次重復(fù)，每盆10株麥苗。在16～20℃溫室中隔離培養(yǎng)，接種10天后調(diào)查發(fā)病程度。參考司權(quán)民等［15］的調(diào)查方法，記載接菌葉片的病情反應(yīng)型，其中0、0；、1和2型為抗病反應(yīng)型，3和4型為感病反應(yīng)型，并計(jì)算毒性頻率。毒性頻率（%）＝毒力菌株／供試菌株×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)毒性鑒定結(jié)果，將有毒性的菌株記為“1”，無毒性的記為“0”。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYS pc 2.11對小麥白粉病菌群體毒性矩陣進(jìn)行UPGMA聚類分析［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東省各地小麥白粉病菌株毒性鑒定

利用32個(gè)寄主對德州、煙臺、濟(jì)寧、濟(jì)南、聊城、臨沂6市供試小麥白粉病菌株分別進(jìn)行毒性鑒定，結(jié)果（表2）顯示，62個(gè)菌株對濟(jì)南15的毒性頻率均為100%，除了鑒別寄主中的兩個(gè)對照（Chancellor、阿夫）和當(dāng)?shù)馗胁φ眨?jì)南15），德州市小麥白粉病菌群體對12個(gè)抗性基因或組合的毒性頻率高于70%，分別為Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm7、Pm8、Pm19、Pm2＋Ta、Pm“Era”和Pm“XBD”；煙臺市有15個(gè)，比德州市多了Pm3d、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm17；濟(jì)寧市有22個(gè)，比德州市多了Pm2、Pm3d、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm6（寄主名稱為Timgalen）、Pm13、Pm2＋6和Pm4＋8；濟(jì)南市有23個(gè)，和德州市相比，除對抗性基因Pm2＋Ta低于70%外，毒性頻率高于70%的抗性基因還有Pm2、Pm3a、Pm3d、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm6（寄主名稱為Timgalen）、Pm13、Pm17、Pm2＋6和Pm2＋Mld；聊城市除了Pm21、Pm1＋2＋9、Pm4b＋5b和Pm5＋6，臨沂市除了Pm21外，對其余抗性基因的毒性頻率均高于70%。說明這些抗性基因已失去抗性。

德州市小麥白粉病菌群體對Pm4b、Pm5b、Pm21、Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2＋Mld、Pm4＋8、Pm4b＋5b及Pm5＋6抗性基因的毒性頻率低于30%，并且對Pm4b、Pm5b、Pm21、Pm2＋6、Pm 2＋Mld、Pm4b＋5b及Pm5＋6共7個(gè)抗性基因的毒性頻率均為0；與德州市相比，煙臺市小麥白粉病菌群體對除了Pm1＋2＋9外的8個(gè)抗性基因的毒性頻率低于30%；濟(jì)寧市和濟(jì)南市相同，只對抗性基因Pm21和Pm1＋2＋9的毒性頻率低于30%；聊城市和臨沂市的小麥白粉病菌群體僅對抗性基因Pm21的毒性頻率低于30%，說明這些抗性基因在當(dāng)?shù)厝詾橛行Щ颉?/p>

2.2 小麥白粉病菌群體毒性結(jié)構(gòu)

如圖1所示，除兩個(gè)鑒別寄主對照及感病對照外，62個(gè)小麥白粉病菌株對17個(gè)抗性基因或組合的毒性頻率均高于70%，分別為Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3d、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm6（寄主名稱為Coker747）、Pm6（寄主名稱為Timgalen）、Pm7、Pm8、Pm13、Pm17、Pm19、Pm2＋Ta、Pm“Era”和Pm“XBD”，說明這些抗性基因已失去抗性；對抗性基因Pm21、Pm4b＋5b及Pm5＋6的毒性頻率低于30%，其中對Pm21抗性基因的毒性頻率為0；對Pm2、Pm3a、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2＋Mld及Pm4＋8共9個(gè)抗性基因的毒性頻率介于37.10%～66.13%。

表2 山東省各地小麥白粉病菌株毒性頻率

2.3 小麥白粉病菌株毒性多態(tài)性分析

由圖2可知，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.67時(shí)，小麥白粉病菌毒性聚類可劃分為兩個(gè)大組，第一大組包括德州市9個(gè)菌株及煙臺市21個(gè)菌株，另外還有濟(jì)南市2個(gè)菌株（JL1和JL2）及1個(gè)濟(jì)寧市菌株JR1；第二大組包括煙臺市其余4個(gè)菌株（YQ1、YQ2、YT1、YY3）、濟(jì)南市2個(gè)菌株（JL3和JL4）、濟(jì)寧市除了JR1外的9個(gè)菌株以及聊城、臨沂市的所有菌株。

62個(gè)小麥白粉病菌株毒性相似系數(shù)在0.67～1.00之間，說明6個(gè)市的小麥白粉病菌群體間毒性存在一定差異。聚類分析結(jié)果表明，小麥白粉病菌毒性多態(tài)性與菌株地理來源有關(guān)，德州與煙臺菌株多聚在一起，濟(jì)寧、聊城、臨沂市的菌株多聚在一起。

3 討論與結(jié)論

本研究對2018年采自山東省德州、煙臺、濟(jì)南、濟(jì)寧、聊城、臨沂6市共62個(gè)小麥白粉病菌株進(jìn)行了毒性監(jiān)測，與2015年的毒性監(jiān)測結(jié)果［11］相比有較大變化：Pm1a、Pm4a、Pm4b、Pm17及Pm“XBD”的毒性頻率上升幅度較大，其中Pm1a、Pm17及Pm“XBD”的毒性頻率已高于80%，完全失去抗性，不能再作為抗性材料使用；Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2和Pm5b的毒性頻率有不同程度的下降，毒性頻率在38.71%～66.13%之間，這可能與近幾年山東各地區(qū)小麥主栽品種的調(diào)整有關(guān)，也可能與采樣地點(diǎn)的不同有一定關(guān)系，仍需要繼續(xù)監(jiān)測；另外，新增的3個(gè)抗性基因Pm13、Pm2＋Ta及Pm“Era”毒性頻率均高于70%，不能作為抗性材料使用。

本研 究 表 明，Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3d、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm13、Pm17、Pm19、Pm2＋Ta、Pm“Era”和Pm“XBD”的毒性頻率均高于70%，其中Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm5a、Pm7、Pm8和Pm19的毒性頻率在全國大部分地區(qū)，如河南［8］、新疆［9］、四川［10］、甘肅［12］、陜西［17］等省份均偏高，但Pm13和Pm“XBD”的毒性頻率在這些省份均偏低。李強(qiáng)等［5］研究表明，Pm6、Pm17、Pm“Era”的毒性頻率在陜西省均偏低，與其他人的研究結(jié)果不一致，未見有關(guān)抗性基因Pm2＋Ta的相關(guān)報(bào)道。本研究表明，Pm2、Pm3a、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm1＋2＋9、Pm2＋6、Pm2＋Mld、Pm4＋8、Pm4b＋5b及Pm5＋6共11個(gè)抗性基因的毒性頻率介于29.03% ～66.13%，所有供試菌株對抗性基因Pm21的毒性頻率均為0，說明Pm21對供試小麥白粉病菌株具有極強(qiáng)的抗性，與許多研究者的報(bào)道一致［5，8，9，17，18］，但也應(yīng)避免大面積單一種植而造成抗性喪失。

本研究比較了德州、煙臺、濟(jì)南、濟(jì)寧、聊城、臨沂6個(gè)市的小麥白粉菌群體之間的毒性頻率。結(jié)果表明，31個(gè)鑒別寄主，除了2個(gè)對照外，德州市小麥白粉病菌群體對12個(gè)抗性基因或組合的毒性頻率高于70%，同時(shí)對7個(gè)抗性基因的毒性頻率等于0，說明德州市小麥白粉病菌群體普遍毒性較弱，甚至部分鑒別寄主表現(xiàn)為免疫；煙臺市有15個(gè)抗性基因的毒性頻率高于70%，可以將德州市、煙臺市篩選出的有效基因結(jié)合利用，尤其一些累加基因組合，如Pm4＋8、Pm4b＋5b及Pm5＋6；濟(jì)寧市和濟(jì)南市分別有22、23個(gè)抗性基因的毒性頻率高于70%，而且兩市的所有菌株對抗性基因Pm1＋2＋9的毒性頻率均為0，這與2013年的研究結(jié)果差異較大，也與前人研究結(jié)果不盡相同［6-10］，后續(xù)仍需要密切監(jiān)測；聊城市除了Pm21、Pm1＋2＋9、Pm4b＋5b和Pm5＋6，臨沂市除了Pm21外，白粉病菌群體對其余抗性基因的毒性頻率均高于70%，說明這兩市小麥白粉病菌群體毒性較強(qiáng)，大多數(shù)抗性基因已失去抗性，需要另外尋找抗性基因利用。

本研究對所有供試菌株進(jìn)行聚類分析表明，德州市的所有菌株和煙臺市的大部分菌株聚在一起，并交錯(cuò)排列，說明兩地白粉病菌株相似度比較高，但兩市地理距離比其他市更遠(yuǎn)，其中的原因還需要加深研究；濟(jì)寧、聊城及臨沂的菌株多聚在一起，說明這3個(gè)地方的小麥白粉病菌株群體毒性較為接近。濟(jì)寧、聊城及臨沂市位于山東省西南部，氣候較為相似，為避免今后小麥白粉病菌群體間的基因交流，應(yīng)避免大面積種植單一、相同的小麥品種。濟(jì)南市的白粉病菌株在兩組中均有排布，還需進(jìn)一步監(jiān)測。

小麥白粉病菌株群體的毒性結(jié)構(gòu)隨時(shí)間、地點(diǎn)不同呈動(dòng)態(tài)變化，利用鑒別寄主對其進(jìn)行毒性監(jiān)測是最直觀、最基礎(chǔ)的工作，需要持續(xù)進(jìn)行以掌握其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。下一步應(yīng)利用SNP標(biāo)記、SRAP標(biāo)記等技術(shù)開展小麥白粉病菌株遺傳多樣性研究［19］。抗性基因Pm21對小麥白粉病具有廣譜抗性，建議將其與其他有效抗性基因結(jié)合利用，以豐富抗病基因的多樣性，或通過分子生物學(xué)手段揭示其抗性機(jī)制，進(jìn)行Pm21基因特異性標(biāo)記開發(fā)和利用，為小麥抗病育種及選擇栽培品種提供理論依據(jù)［20］。