香蕉條斑病毒病和花葉病混合感染的癥狀及其分子檢測①

王艷瑋 漆艷香 曾凡云 張 欣 謝藝賢 彭 軍

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所 海南海口571101)

香蕉條斑病毒（Banana streak virus，BSV）和香蕉花葉心腐病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是危害中國香蕉的2 種重要病毒，植株染病后矮縮甚至死亡，造成果實品質(zhì)和產(chǎn)量嚴重下降。香蕉主要通過組培技術(shù)進行無性繁殖， 種苗一旦帶毒，將加劇香蕉病毒的傳播和危害。

香蕉條斑病毒是香蕉上的一種重要病毒。BSV屬于桿狀病毒屬（Badnavirus），含有7.2～7.8 kb的雙鏈環(huán)狀DNA（dsDNA）編碼3 個ORFs［1］。ORF1編碼功能未確定的小分子蛋白，可能與病毒粒子形成相關(guān)；ORF2 編碼一個大約14 ku 的蛋白，含有N 末端Coiled-coil 功能域，推測與病毒粒子組裝相關(guān)；ORF3 編碼一個復合蛋白，該蛋白通過剪切作用產(chǎn)生病毒外殼蛋白（Coat Protein， CP）、天冬氨酸酶（Aspartic Protease， AP）、反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase， RT）、核糖核酸酶H（RNase H， RH）以及移動蛋白（Movement Protein， MP）等。BSV 具有整合進入香蕉基因組的特性。當香蕉受到外部環(huán)境脅迫，BSV 整合香蕉基因組的BSV，使其成為內(nèi)源BSV（endogenous BSV，eBSV）游離出來獨立于染色體外，成為游離BSV（episomal BSV），從而使香蕉植株表現(xiàn)出染病癥狀［2］。據(jù)報道，近年來中國廣東、云南、海南等香蕉主要種植地區(qū)先后有香蕉條斑病發(fā)生，該病早期癥狀表現(xiàn)為米粒狀的褪綠，隨著癥狀的發(fā)展，葉片出現(xiàn)斷續(xù)或連續(xù)的褪綠條斑及梭形條斑，并可逐漸發(fā)展成壞死黑色條斑，假莖、葉柄及果穗有時也會出現(xiàn)條紋癥狀［3-4］。

香蕉花葉病是由黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）引起的一種病毒病，被該病毒侵染的香蕉會出現(xiàn)植株矮化的癥狀，且與正常植株對比，該病株的葉片會有濃綠鑲嵌的斑駁、花葉狀條紋或褪綠的梭狀斑，嚴重者嫩葉出現(xiàn)嚴重黃化或斑駁，直到變褐腐爛［5］。

為調(diào)查海南省BSV 和CMV 的發(fā)生情況，在2019年12 月份海南持續(xù)低溫的一周內(nèi)對幾個主要香蕉種植園進行調(diào)查，為后續(xù)香蕉病毒病的防治以及健康組培苗的監(jiān)測提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疑似病株

隨機采集海南澄邁、陵水部分香蕉種植園具BSV、CMV 疑似癥狀的病株，帶回實驗室保存，將經(jīng)PCR 檢測、測序后確定有CMV、BSV 感染的香蕉植株作為陽性對照（+CK）， 健康香蕉植株作為陰性對照（-CK）。

1.1.2 試劑

TaqDNA 聚合酶等購自大連寶生物工程（Ta-KaRa）有限公司，引物由上海生物工程公司合成（HPLC 純化），RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒等購自TIANGEN 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)BSV 的ORF3 基因組序列設(shè)計BSV-P1/P2 特異性檢測引物（表1），可以擴增出eBSV/BSV 2 種形式的BSV［6］。根據(jù)CMV 外殼蛋白基因序列，通過比較多個株系之間的保守序列設(shè)計引物［7］。

表1 CMV 和BSV 引物序列

1.2.2 總RNA 的提取及cDNA合成

取0.1 g 的香蕉疑似樣品的葉片，用液氮充分研磨成細粉狀，收集至2 mL 離心管中并做好樣品標記。按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作說明提取病葉RNA；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，Nanadrop 測定OD260/280，于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒，將提取到的總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再將cDNA 溶液放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增驗證

分別對BSV cDNA 和CMV cDNA 進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為50 μL（2×Taq mix 25.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，H2O 21.0 μL）；PCR 擴 增 條 件：94 ℃預(yù) 變 性5 min，95 ℃變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延長1 min ，進行35 次循環(huán)，72 ℃延長5 min ，16 ℃降溫5 min。取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間觀察結(jié)果

田間觀察發(fā)現(xiàn)，部分田間香蕉葉片具斷續(xù)或連續(xù)的褪綠條斑，甚至部分葉片葉脈枯死，這些是BSV典型癥狀；而其他葉片出現(xiàn)棱形或不規(guī)則花葉斑駁狀，為典型CMV癥狀。部分香蕉植株頂部葉片有明顯的花葉狀斑紋，而下部的葉片則呈現(xiàn)褪綠條斑狀（圖1），分別與CMV 和BSV 的病毒癥狀一致，初步判斷為CMV和BSV混合感染。

2.2 BSV和CMV的PCR檢測

2.2.1 BSV檢測結(jié)果

PCR 擴增電泳結(jié)果中出現(xiàn)了2條亮度明顯的條帶，第一條帶位于1 000 bp 附近位置，第二條則在500～750 bp。與+CK 比對可知，第一條帶為目的片段，第二條帶則是整合到基因組的eBSV 擴增條帶。結(jié)果表明疑似癥狀香蕉植株都攜帶BSV，由于低溫脅迫，eBSV 游離出來，形成未整合到基因組、獨立于染色體外的游離BSV（episomal BSV），從而使香蕉植株表現(xiàn)出染病癥狀（圖2）。

2.2.2 CMV RT-PCR檢測結(jié)果

在BSV 檢測呈陽性的樣品中，隨機選擇10 個樣片提取RNA 后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，CMV 擴增電泳結(jié)果顯示，擴增條帶與+CK 條帶對比完全一致，測序結(jié)果進一步驗證了疑似病株中的確存在香蕉花葉心腐病感染（圖3）。

3 討論

香蕉病毒病是限制香蕉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一，不同病毒間可能會存在混合感染的現(xiàn)象，前期通過田間調(diào)查及分子檢測發(fā)現(xiàn)，在云南、海南、廣東等地區(qū)普遍存在BBTV 和CMV 混合感染的現(xiàn)象［7-8］。近年來由于未對香蕉條斑病毒進行嚴格檢疫，香蕉條斑病在華南地區(qū)的發(fā)生十分普遍。香蕉條斑病的癥狀與香蕉花葉病癥狀比較接近，且癥狀表現(xiàn)受到溫度的影響，因此難以根據(jù)癥狀進行準確判斷，給檢測造成了一定的困難。利用海南低溫天氣開展的田間癥狀調(diào)查顯示，具BSV、CMV 疑似癥狀的樣品大部分含有整合到基因組的eBSV和游離的BSV。此外，大部分感病香蕉植株的頂端葉片出現(xiàn)典型的CMV癥狀，而下部葉片出現(xiàn)典型的BSV 癥狀，隨機對部分BSV 陽性樣品進行CMV RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，此部分香蕉植株存在BSV 和CMV混合感染。后續(xù)隨著氣溫的升高以及香蕉的健康生長，BSV癥狀基本消失。

對于病毒病的防治，首先加強種苗的監(jiān)測和檢測，保證無毒香蕉苗是控制該病的主要措施之一。香蕉無毒種苗主要通過組培工廠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，一旦種苗帶毒，病毒隨種苗擴繁將加劇香蕉病毒的傳播和危害。其次，當香蕉受到低溫脅迫時，會呈現(xiàn)更為明顯的香蕉條斑病毒癥狀。因此，在香蕉生長過程中注意觀察癥狀，并結(jié)合PCR檢測技術(shù)，防止種苗攜帶BSV病毒而造成嚴重危害。