• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    貝萊斯芽孢桿菌總RNA提取的Trizol改良法①

    2020-08-31 07:10:10龔禹瑞袁亞男尚靜靜張樹竹陳本佳秦世雯
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:改良法溶菌酶離心管

    王 松 龔禹瑞 袁亞男 尚靜靜 張樹竹 陳本佳 秦世雯

    (云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/云南省多年生稻工程技術(shù)研究中心 云南昆明650500)

    貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種,屬于革蘭氏陽性菌,存在于土壤、水體、動(dòng)植物體內(nèi)[1]。近年來,國(guó)內(nèi)外研究人員相繼分離到不同的B.velezensis菌株,發(fā)現(xiàn)其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌及食品發(fā)酵等方面發(fā)揮良好作用,且對(duì)環(huán)境友好、易于人工培養(yǎng),在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用研究?jī)r(jià)值[2-5]。獲得高質(zhì)量總RNA 是進(jìn)行RT-PCR、qRT-PCR、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建、Northern 雜交、轉(zhuǎn)錄組和翻譯組測(cè)序等研究的基礎(chǔ)[6-8]。因此,高效、簡(jiǎn)便的B.velezensis總RNA提取方法對(duì)該菌的深入研究和利用至關(guān)重要。

    目前常見的細(xì)菌總RNA 提取方法有CTAB 法、強(qiáng)變性劑法、SDS-Phenol法及熱硼酸法等[7,9],這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn),并根據(jù)菌體特性適用于不同細(xì)菌類型。有效的細(xì)胞裂解是提取高產(chǎn)量細(xì)菌總RNA 的關(guān)鍵步驟。目前細(xì)菌細(xì)胞壁破碎的方法有酶解法、玻璃珠法和超聲波法[10-11]。相對(duì)于真核生物,細(xì)菌的RNA含量少,半衰期短,易降解;內(nèi)外環(huán)境以及操作體系無處不在的RNA 酶(RNase)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌總RNA提取效果不理想[7]。此外,破碎的細(xì)胞內(nèi)含物常與RNA 形成難溶的物質(zhì),導(dǎo)致RNA 難以分離。而國(guó)內(nèi)關(guān)于高質(zhì)量總RNA提取研究多集中于真核生物,尚缺乏高效、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的細(xì)菌高質(zhì)量總RNA提取方法。

    Trizol 法能夠快速高效分離不同的生物來源樣品的總RNA,所提取的總RNA 濃度和純度高,不需要超速離心或多步酚—氯仿進(jìn)行抽提[7]。然而,常規(guī)Trizol 法不能夠有效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁,且對(duì)RNase 的抑制效果并不理想,無法獲得高質(zhì)量的細(xì)菌總RNA[9]。因此,針對(duì)B.velezensis分泌蛋白量大且種類多、細(xì)胞壁厚等特點(diǎn),本研究通過優(yōu)化菌體培養(yǎng)條件、洗滌菌體次數(shù)、溶菌酶裂解細(xì)胞、液氮冷凍處理等方法,對(duì)傳統(tǒng)Trizol法進(jìn)行改良,獲得了高質(zhì)量的B.velezensis總RNA,為該菌的分子生物學(xué)研究提供了一種高效、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的總RNA提取技術(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株

    B.velezensis YQ1菌株由云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室分離鑒定并于-80℃中保存。

    1.1.2 主要試劑及儀器

    Trizol 試劑(Invitrogen,美國(guó)),0.1% DEPC水,溶菌酶(200 mg/mL)(Solarbio,北京),D 2 000 DNA Marker(天根,北京),RibopureTMBacteria kit(Invitrogen,美國(guó)),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermofisher,美國(guó))等。

    1.2 方法

    1.2.1 常規(guī)Trizol法

    (1)菌體培養(yǎng)及收集:將保存于-80℃的B.velezensis YQ1 菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng),30℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h。①固體培養(yǎng)條件菌體培養(yǎng)與收集:用接種環(huán)蘸取上述活化菌液在LB 固體培養(yǎng)基上劃線,30℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h 后,取50 mg 菌體至1.5 mL 離心管中。②液體培養(yǎng)條件菌體培養(yǎng)與收集培養(yǎng):將1 mL上述活化菌液加入200 mL LB 培養(yǎng)基中,30℃,180 r/min振蕩培養(yǎng),待OD600值達(dá)到1.0,8 000 g,4℃離心5 min,棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。

    (2)總RNA 提取步驟:①往上述離心管加入0.75 mL Trizol 試劑,移液器吸打混勻菌體,以最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩3~5 min;②室溫孵育5~10 min。加入0.2 mL 氯仿,上下顛倒混勻,室溫孵育2~3 min;③4℃、12 000 g 離心10 min;④吸取上清,加入等體積的異丙醇,上下顛倒混勻,置于20℃中冰凍10 min;⑤4℃、12 000 g 離心10 min;棄上清,加1 mL 75%乙醇,溫和振蕩5~10 s;⑥4℃、7 500 g 離心5 min;⑦棄上清,超級(jí)工作臺(tái)中晾置5~10 min 至乙醇完全揮發(fā);⑧加入30~50 μL DEPC水溶解,獲得的總RNA于-80℃冰箱保存。

    1.2.2 Trizol改良法

    (1)菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化:①固體培養(yǎng)條件下菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化:將活化菌液劃線至LB固體培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng)24、36和48 h,分別取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。②液體培養(yǎng)條件下菌液OD600值優(yōu)化:1 mL 活化的菌體加入200 mL LB 培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.5、1.0、1.5 和2.0 時(shí),8 000 g,4℃離心5 min,棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL 離心管中。

    (2)菌體DEPC 水處理:用25 mL 0.1%DEPC 水洗滌菌體,洗滌次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4 次,充分混勻菌體后,4℃,8 000 g離心5 min,棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。

    (3)溶菌酶處理:向最適DEPC 水處理后的菌體中加1 mL DEPC 水,混勻后分別加入20、30、40 μL 的溶菌酶,37℃靜置30 min,4℃、10 000 g 離心1 min,收集菌體。

    (4)液氮處理:將最適溶菌酶處理后的菌體置于1.5 mL離心管中,液氮冷凍2~3 min,未進(jìn)行液氮處理的菌體設(shè)置為對(duì)照。加入Trizol 試劑前將上述離心管取出后置于冰上融化。

    (5)總RNA 的提?。嚎俁NA 提取步驟同上述常規(guī)Trizol法總RNA提取步驟。

    1.2.3 改良Trizol法與試劑盒法的比較

    RibopureTMBacteria Kit 試劑盒總RNA 提 取 方法如下:取1 mL 菌液(OD600為1.0),將250 μL 氧化鋯珠滴入0.5 mL 的螺旋蓋中;離心收集樣品,加入350 μL RNAWTZ,渦旋振蕩均勻,將RNAWTZ中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到250 μL 的氧化鋯珠,擰緊蓋子,渦旋器中最大轉(zhuǎn)速振蕩10 min,充分溶解;4℃,14 000 g離心5 min;溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管,加入0.2 倍體積的氯仿,混勻,室溫孵育10 min;4℃、14 000 g 離心5 min;水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管,加0.5倍體積的無水乙醇,完全混合,將濾器放入2 mL 的收集管,將樣品轉(zhuǎn)移到濾器中;4℃、14 000 g 離心1 min;棄濾筒,濾器轉(zhuǎn)入新的 濾 筒,加700 μL Wash Solution 1;4℃、14 000 g 離心1 min;丟棄濾筒,過濾器放入收集管,加500 μL Wash Solution 2/3;4℃、14 000 g離心1 min;棄濾筒,過濾器放入收集管,重復(fù)上述步驟一次;4℃、14 000 g 離心1 min,轉(zhuǎn)移到2 mL的收集管;將預(yù)熱至95℃的25~50 μL洗脫液加到濾池中心;4℃、14 000 g 離心1 min;重復(fù)上述兩步一次,獲得的總RNA于-80℃冰箱保存。

    1.2.4 總RNA質(zhì)量及完整性檢測(cè)

    (1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):取總RNA 樣品4~5 μL,于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。200 V恒壓,16 min。凝膠成像儀上觀察條帶,并記錄結(jié)果。

    (2)RNA 純度和濃度檢測(cè):取2 μL 總RNA 樣品,用超微量紫外分光光度計(jì)(Thermofisher,美國(guó))分別檢測(cè)A260/A280、A260/A230及濃度(ng/μL)??俁NA 的A260/A280值為2.0 且A260/A230值 為2.0~2.5時(shí)為高純度總RNA。

    (3)cDNA 的合成和擴(kuò)增質(zhì)量鑒定:利用RTPCR 法對(duì)Trizol 改良法提取的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增質(zhì)量鑒定,以常規(guī)法提取的總RNA作為對(duì)照。根據(jù)Takara AMV (V 3.0) Reverse Transcriptase(Takara,大連)的說明進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成和RT-PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 擴(kuò)增片段為B.velezensis16S rRNA片段,所用引物為(F:5’-CTTCGGGTGTTACAAACTCTCG-3’;R:5’-TAAGCCAATCCCACAAATCTG-3’),利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 常規(guī)Trizol法提取

    如圖1 所示, 常規(guī)Trizol 法提取的B.velezensis總RNA 存在明顯的降解,且A260/A280和A260/A230值均小于2.0(表1),說明有雜質(zhì)污染。推測(cè)培養(yǎng)基殘留,B.velezensis培養(yǎng)過程中分泌物多,菌體細(xì)胞壁未完全破裂,造成常規(guī)Trizol 法無法提取到該菌完整的總RNA。

    表1 常規(guī)Trizol法提取Bacillus velezensis總RNA的濃度和質(zhì)量

    2.2 Trizol改良法提取

    2.2.1B.velezensis培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    在進(jìn)行菌體培養(yǎng)時(shí),若B.velezensis生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期之前收集菌體,菌體量少;而進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,B.velezensis分泌大量的胞外酶(包括RNase),嚴(yán)重影響總RNA提取質(zhì)量。為明確菌體培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)B.velezensis總RNA 提取的影響,分別取LB 固體和液體培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體進(jìn)行總RNA提取。如圖2和表2所示,在LB固體培養(yǎng)基條件下,24 h的總RNA濃度和純度相對(duì)較高,說明在LB 固體培養(yǎng)基條件下,應(yīng)盡量選取24 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期)的菌體進(jìn)行總RNA 抽提。但24、36、48 h 總RNA 均有不同程度的降解,且A260/A280和A260/A230值均小于2.0(表2),說明有蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)污染。

    表2 LB固體培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)時(shí)間B.velezensis總RNA的濃度和質(zhì)量

    如圖3 所示,在LB 液體培養(yǎng)基條件下當(dāng)菌體OD600值為1.0 和1.5 時(shí)能夠提取質(zhì)量較高的總RNA,但存在降解,且A260/A280和A260/A230值均小于2.0(表3),說明有蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)污染;而OD600值為0.5 和2.0 時(shí)總RNA 嚴(yán)重降解。說明在LB 液體培養(yǎng)基條件下,菌體培養(yǎng)至OD600值為1.0~1.5 時(shí)是最佳的總RNA提取時(shí)間。

    2.2.2 不同洗滌次數(shù)預(yù)處理對(duì)B.velezensis總RNA提取的影響

    表3 LB液體培養(yǎng)基條件下不同B.velezensis菌體OD600值的總RNA濃度和質(zhì)量

    收集菌體時(shí),殘留的培養(yǎng)基和菌體分泌物等對(duì)總RNA提取存在嚴(yán)重影響,因此本研究采用DEPC水洗滌菌體的方法來減少雜質(zhì)和RNase影響。為明確洗滌次數(shù)對(duì)減少雜質(zhì)和菌體分泌物的效果,分別對(duì)LB 液體培養(yǎng)基條件下收集的菌體(OD600值為1.0)進(jìn)行1、2、3、4次洗滌。如圖4和表4所示,洗滌2 次的B.velezensis總RNA 質(zhì)量較高,但均存在一定程度的降解。另外,DEPC 水洗滌處理后,總RNA濃度較低,不利于后續(xù)進(jìn)行RNA純化處理。

    表4 DEPC水洗滌處理后B.velezensis 總RNA的濃度和質(zhì)量

    2.2.3 溶菌酶處理對(duì)B.velezensis總RNA提取的影響

    為提高B.velezensis總RNA 提取量,需完全裂解菌體細(xì)胞壁,釋放核酸。本研究將上述DEPC水洗滌2次后的菌體,分別用20 μL(20 mg)、30 μL(30 mg)、40 μL(40 mg)溶菌酶處理菌體。如圖5和表5 所示,溶菌酶處理后,總RNA 濃度得到了明顯提高,30 μL(30 mg)溶菌酶處理后提取的總RNA質(zhì)量和濃度最高,但仍存在一定程度降解(表5)。說 明30 μL(30 mg) 溶 菌 酶 能 夠 完 全 裂 解B.velezensis(OD600值為1.0)細(xì)胞壁,保證高濃度的總RNA提取量。

    表5 溶菌酶處理后B.velezensis總RNA濃度和質(zhì)量

    2.2.4 液氮冷凍處理菌體對(duì)B.velezensis總RNA 提取的影響

    通過DEPC 水洗滌和溶菌酶處理后,提取的總RNA仍存在降解情況,說明B.velezensis體內(nèi)或提取過程中仍有RNAase 的影響。為抑制RNAase 活性,本研究對(duì)上述30 μL(30 mg)溶菌酶處理的菌體進(jìn)行液氮冷凍。如圖6 所示,提取菌體的總RNA可以清晰的看到23S、16S 和5S 條帶。相較于未進(jìn)行液氮處理的樣品,液氮處理后提取的總RNA降解程度少,并且濃度和純度高(表6),說明液氮處理能夠有效降低B.velezensis內(nèi)源性和提取過程中RNAase活性。

    2.3 Trizol改良法和試劑盒法比較

    表6 液氮冷凍處理提取B.velezensis總RNA的質(zhì)量和濃度比較

    由以上結(jié)果確定了B.velezensis總RNA Trizol改良法。為比較其與試劑盒法提取的總RNA效果,選取革蘭氏陽性菌總RNA提取試劑盒RibopureTMBacteria Kit。如圖7 所示,2 種方法均能獲得完整和高純度的總RNA,而Trizol法改良法提取的總RNA濃度更高,但相對(duì)于試劑盒法提取時(shí)間較長(zhǎng)(表7)。另外,試劑盒法提取的單個(gè)樣本總RNA價(jià)格比Trizol 改良法昂貴。因此Trizol 改良法適用于B.velezensis大批量樣本的總RNA 提取,而試劑盒法適用于小批量樣本的總RNA快速提取。

    2.4 RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)

    表7 Trizol改良法和試劑盒法提取的B.velezensis總RNA濃度和質(zhì)量

    以Trizol 常規(guī)法和改良法所提取的總RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。隨后以其為模板,利用B.velezensis16S rRNA的熒光定量PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,Trizol常規(guī)法提取的總RNA 無法擴(kuò)增出16S rRNA 片段,而Trizol 改良法提取的總RNA 能夠擴(kuò)增出明顯的16S rRNA 片段,且片段大小與預(yù)期相符(163 bp),說明Trizol 改良法提取的總RNA能夠滿足RT-PCR要求。

    3 討論與結(jié)論

    B.velezensis不僅具有富含肽聚糖的細(xì)胞壁,還具有強(qiáng)大的胞外酶分泌系統(tǒng),同時(shí)易產(chǎn)生內(nèi)源性RNase,這些特點(diǎn)加大了其總RNA提取難度[10-11]。貝萊斯芽孢桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,細(xì)胞分裂旺盛,胞內(nèi)活動(dòng)主要以細(xì)胞分裂相關(guān)為主,細(xì)胞壁積累較少,分泌物較少,易于破碎細(xì)胞并獲得高質(zhì)量的總RNA。由于常規(guī)Trizol 法無法提取到B.velezensis完整的總RNA,因此,本研究比較了不同培養(yǎng)條件下,不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)B.velezensis總RNA提取的影響,結(jié)果表明,LB液體培養(yǎng)條件下的B.velezensis總RNA 提取質(zhì) 量 較好,且OD600值 為1.0~1.5 是最佳提取時(shí)期。針對(duì)B.velezensis具有較強(qiáng)的胞外酶分泌系統(tǒng)特性,本研究通過DEPC水洗滌處理,在一定程度上減少了分泌物和殘留培養(yǎng)基的影響,與枯草芽孢桿菌總RNA提取方法的研究結(jié)果相符[12]。本研究通過加入適量溶菌酶裂解菌體,提高了總RNA濃度,但該方法并不適用于糞腸球菌和金黃色葡萄球菌[13-14],推測(cè)溶菌酶對(duì)不同革蘭氏陽性菌的裂解效率存在差異。另外,本研究通過對(duì)菌體液氮冷凍處理后發(fā)現(xiàn),液氮能夠抑制菌體破裂后的RNAase 活性,防止總RNA 在提取過程中的降解[10]。本研究還比較了Trizol 改良法與試劑盒提取B.velezensis總RNA 濃度效果,結(jié)果表明Trizol 改良法更加適合于大批量B.velezensis總RNA提取。

    本研究提供了一種簡(jiǎn)便有效的B.velezensis總RNA 提取方法,為滿足B.velezensis相關(guān)分子生物學(xué)研究提供了重要的技術(shù)支撐。

    猜你喜歡
    改良法溶菌酶離心管
    偶氮類食品著色劑誘惑紅與蛋溶菌酶的相互作用研究
    魔方型離心管架的設(shè)計(jì)及研發(fā)
    科技視界(2020年26期)2020-09-24 03:25:06
    改良法測(cè)量胃管留置長(zhǎng)度對(duì)腦卒中患者胃內(nèi)殘留量監(jiān)測(cè)的影響
    離心管架研究現(xiàn)狀及魔尺型離心管架的設(shè)計(jì)
    科技視界(2020年17期)2020-07-30 14:03:27
    改良法口服硫酸鋇X線下復(fù)位胃扭轉(zhuǎn)的應(yīng)用價(jià)值
    改良法處理人脫細(xì)胞真皮的脫細(xì)胞效果及其與體外細(xì)胞的相容性研究
    燃燒條件演示實(shí)驗(yàn)的新設(shè)計(jì)
    初發(fā)翼狀胬肉切除聯(lián)合羊膜移植術(shù)改良法與傳統(tǒng)法療效對(duì)比研究
    動(dòng)物型溶菌酶研究新進(jìn)展
    溶菌酶治療兔大腸桿菌病的研究
    国产精品人妻久久久影院| 七月丁香在线播放| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费少妇av软件| 国产男女超爽视频在线观看| av片东京热男人的天堂| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 1024香蕉在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 日日撸夜夜添| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久99一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看 | 精品久久蜜臀av无| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 女性生殖器流出的白浆| e午夜精品久久久久久久| 热re99久久国产66热| 美女视频免费永久观看网站| 国产一区二区激情短视频 | 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩大片免费观看网站| 咕卡用的链子| 午夜影院在线不卡| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久这里只有精品19| 欧美久久黑人一区二区| 黄色 视频免费看| 亚洲久久久国产精品| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美另类一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产xxxxx性猛交| 国产av码专区亚洲av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一级毛片我不卡| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产欧美亚洲国产| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品女同一区二区软件| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲成色77777| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 美国免费a级毛片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产福利在线免费观看视频| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲精品第二区| 国产av一区二区精品久久| 交换朋友夫妻互换小说| 丰满迷人的少妇在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲成人免费av在线播放| 免费高清在线观看日韩| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 精品国产一区二区久久| av国产久精品久网站免费入址| av线在线观看网站| av.在线天堂| 各种免费的搞黄视频| av不卡在线播放| av在线老鸭窝| 一级,二级,三级黄色视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 最近的中文字幕免费完整| 免费看不卡的av| 18在线观看网站| 久久综合国产亚洲精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久国产精品大桥未久av| 七月丁香在线播放| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 午夜av观看不卡| 看免费av毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 免费观看性生交大片5| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 免费观看人在逋| 各种免费的搞黄视频| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美人与善性xxx| 最黄视频免费看| 男男h啪啪无遮挡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 91老司机精品| 日日啪夜夜爽| 亚洲国产欧美一区二区综合| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩av不卡免费在线播放| 久久ye,这里只有精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99国产精品免费福利视频| 69精品国产乱码久久久| av电影中文网址| 美女午夜性视频免费| 日韩一本色道免费dvd| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 黄频高清免费视频| 精品第一国产精品| 九九爱精品视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 悠悠久久av| 国产成人精品在线电影| 男女边吃奶边做爰视频| 18禁动态无遮挡网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| av片东京热男人的天堂| 日韩一区二区三区影片| 国产av精品麻豆| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 韩国高清视频一区二区三区| 国产一区二区激情短视频 | 最黄视频免费看| 午夜91福利影院| 日韩电影二区| av在线观看视频网站免费| 丰满乱子伦码专区| 丁香六月欧美| 亚洲欧美激情在线| 亚洲国产看品久久| 欧美在线一区亚洲| 久久影院123| 中文字幕亚洲精品专区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 丝瓜视频免费看黄片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 天堂8中文在线网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 中文字幕亚洲精品专区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一级黄片播放器| 大香蕉久久网| 国产精品三级大全| 欧美日韩亚洲高清精品| av网站免费在线观看视频| 国产一区二区 视频在线| 韩国精品一区二区三区| 男女免费视频国产| 久久97久久精品| 一个人免费看片子| 日本色播在线视频| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美激情 高清一区二区三区| 操出白浆在线播放| 午夜激情av网站| 免费在线观看完整版高清| 亚洲国产av新网站| 秋霞在线观看毛片| 亚洲av电影在线进入| 国产成人欧美在线观看 | kizo精华| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲欧洲国产日韩| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| av不卡在线播放| 亚洲,欧美精品.| 亚洲国产av新网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人精品无人区| 久久综合国产亚洲精品| 国产野战对白在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品国产av在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产av精品麻豆| 久久ye,这里只有精品| 老熟女久久久| 街头女战士在线观看网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99re6热这里在线精品视频| 成人国产av品久久久| 国产福利在线免费观看视频| 在线观看免费高清a一片| 男女无遮挡免费网站观看| av免费观看日本| 不卡av一区二区三区| 午夜福利,免费看| 十分钟在线观看高清视频www| 99热全是精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲成人手机| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品免费视频内射| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久韩国三级中文字幕| 免费看不卡的av| 99热网站在线观看| 老司机靠b影院| 国产成人精品无人区| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美精品亚洲一区二区| 国产av码专区亚洲av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 男女无遮挡免费网站观看| 操出白浆在线播放| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲情色 制服丝袜| 9热在线视频观看99| 国产成人欧美在线观看 | 国产成人精品久久二区二区91 | 欧美日韩亚洲高清精品| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 咕卡用的链子| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 五月天丁香电影| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 各种免费的搞黄视频| 一区二区三区激情视频| 欧美人与善性xxx| 成人国产av品久久久| 一级毛片我不卡| www.自偷自拍.com| 国产成人精品在线电影| 精品久久蜜臀av无| 欧美日韩精品网址| 久久毛片免费看一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲精品在线美女| 黄色一级大片看看| 日本午夜av视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久国产电影| 国产成人精品在线电影| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美黑人精品巨大| 高清不卡的av网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人免费观看mmmm| av女优亚洲男人天堂| 久久狼人影院| 久久免费观看电影| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 国产97色在线日韩免费| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 99香蕉大伊视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 日本午夜av视频| 九色亚洲精品在线播放| 久久99一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| 高清视频免费观看一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 两个人免费观看高清视频| 少妇人妻 视频| 在线观看www视频免费| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲四区av| 国产成人精品在线电影| 美女福利国产在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费看不卡的av| 在线观看三级黄色| 搡老岳熟女国产| 成人国产麻豆网| 亚洲精品在线美女| 国产黄频视频在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 久久婷婷青草| 高清av免费在线| 伊人久久国产一区二区| 久久这里只有精品19| 丝袜在线中文字幕| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久久久久久久久大奶| 丝袜脚勾引网站| 在线天堂最新版资源| 丁香六月欧美| 五月开心婷婷网| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利一区二区在线看| 国产男人的电影天堂91| 国产精品久久久av美女十八| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 又大又黄又爽视频免费| 国产日韩欧美视频二区| av在线观看视频网站免费| 午夜激情av网站| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品卡一卡二卡四卡免费| 不卡视频在线观看欧美| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品一二三| 高清av免费在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 嫩草影视91久久| 日本午夜av视频| 亚洲精品在线美女| 国产 一区精品| 韩国av在线不卡| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美人与性动交α欧美软件| 成年美女黄网站色视频大全免费| 超碰成人久久| 51午夜福利影视在线观看| 丰满少妇做爰视频| 丝袜美腿诱惑在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| videosex国产| 国产免费一区二区三区四区乱码| 最近中文字幕2019免费版| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美日本中文国产一区发布| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 精品一区二区三区av网在线观看 | 多毛熟女@视频| avwww免费| 成人三级做爰电影| 国产淫语在线视频| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久人妻熟女aⅴ| 高清欧美精品videossex| 国产精品av久久久久免费| av卡一久久| 国产成人精品福利久久| 国产成人a∨麻豆精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品少妇内射三级| videosex国产| av电影中文网址| 在线天堂最新版资源| 一级毛片我不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 高清欧美精品videossex| 免费观看人在逋| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线天堂最新版资源| 午夜福利影视在线免费观看| 在线看a的网站| 在现免费观看毛片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产日韩欧美视频二区| 波多野结衣一区麻豆| 如何舔出高潮| 人人妻人人澡人人看| 久久人人97超碰香蕉20202| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲精品国产av蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 丝瓜视频免费看黄片| 国产一区二区在线观看av| av线在线观看网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 在线观看三级黄色| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日日撸夜夜添| 久久狼人影院| 久久久久人妻精品一区果冻| 捣出白浆h1v1| 丝袜美足系列| 性高湖久久久久久久久免费观看| 丝袜美足系列| 51午夜福利影视在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 51午夜福利影视在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲精品第二区| 大香蕉久久成人网| 亚洲国产成人一精品久久久| av片东京热男人的天堂| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 天美传媒精品一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 好男人视频免费观看在线| 国产av码专区亚洲av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久网色| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久久久久电影网| 欧美在线黄色| av一本久久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 男女国产视频网站| 十八禁网站网址无遮挡| 毛片一级片免费看久久久久| 人妻一区二区av| 夫妻午夜视频| 国产一级毛片在线| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| tube8黄色片| 亚洲精品视频女| 最近手机中文字幕大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 美女视频免费永久观看网站| 人成视频在线观看免费观看| 高清不卡的av网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 中国国产av一级| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩大片免费观看网站| 三上悠亚av全集在线观看| 国产成人精品无人区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美97在线视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 另类亚洲欧美激情| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久国产精品大桥未久av| 在线 av 中文字幕| 亚洲人成电影观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99热网站在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 午夜免费鲁丝| 黑丝袜美女国产一区| 免费日韩欧美在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久人人97超碰香蕉20202| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99精国产麻豆久久婷婷| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 爱豆传媒免费全集在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 1024视频免费在线观看| netflix在线观看网站| 捣出白浆h1v1| 天堂8中文在线网| 亚洲第一青青草原| 一级毛片电影观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美色中文字幕在线| 最新在线观看一区二区三区 | 日韩成人av中文字幕在线观看| 宅男免费午夜| 久久ye,这里只有精品| 赤兔流量卡办理| 精品一区在线观看国产| av视频免费观看在线观看| 国产精品免费大片| 欧美97在线视频| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲,欧美,日韩| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| a级毛片在线看网站| 999精品在线视频| 七月丁香在线播放| 1024香蕉在线观看| 99九九在线精品视频| a级毛片在线看网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 色吧在线观看| 免费看不卡的av| av卡一久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久久久视频综合| a级片在线免费高清观看视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久久精品区二区三区| 99热网站在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 韩国精品一区二区三区| 黑人猛操日本美女一级片| av有码第一页| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产又爽黄色视频| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 老汉色∧v一级毛片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲精品一二三| 亚洲国产最新在线播放| 只有这里有精品99| 一个人免费看片子| 我的亚洲天堂| 亚洲七黄色美女视频| 最近的中文字幕免费完整| 成人国产麻豆网| 人妻 亚洲 视频| 中文字幕av电影在线播放| 欧美在线一区亚洲| 999久久久国产精品视频| 日韩av免费高清视频| 捣出白浆h1v1| a级毛片黄视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 美女中出高潮动态图| 亚洲色图综合在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 18禁动态无遮挡网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲中文av在线| 欧美精品亚洲一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品国产av在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品国产三级专区第一集| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄片播放在线免费| 黄频高清免费视频| 欧美 日韩 精品 国产| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久久久久久久免费av| 一级黄片播放器| 色吧在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 又大又黄又爽视频免费| 久久天堂一区二区三区四区| 一本久久精品| 免费观看a级毛片全部| 精品视频人人做人人爽| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一级片免费观看大全| 亚洲国产成人一精品久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 天天添夜夜摸| 国产精品一二三区在线看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品国产露脸久久av麻豆| 韩国高清视频一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线天堂中文资源库| 国产黄色视频一区二区在线观看| 99热网站在线观看| 亚洲在久久综合| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品国产国语对白av| 国产精品无大码| 男人添女人高潮全过程视频| 午夜福利视频精品| 亚洲人成电影观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产1区2区3区精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 波多野结衣av一区二区av| 国精品久久久久久国模美| 1024视频免费在线观看| 丝袜喷水一区| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产日韩欧美在线精品| 在线观看免费高清a一片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级爰片在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 无遮挡黄片免费观看| 黄色怎么调成土黄色| a级毛片在线看网站| 一个人免费看片子| 91精品国产国语对白视频| 最新的欧美精品一区二区| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲人成电影观看| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品国产综合久久久| 香蕉国产在线看| 日韩一区二区视频免费看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 |