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    貝萊斯芽孢桿菌總RNA提取的Trizol改良法①

    2020-08-31 07:10:10龔禹瑞袁亞男尚靜靜張樹竹陳本佳秦世雯
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:改良法溶菌酶離心管

    王 松 龔禹瑞 袁亞男 尚靜靜 張樹竹 陳本佳 秦世雯

    (云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/云南省多年生稻工程技術(shù)研究中心 云南昆明650500)

    貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種,屬于革蘭氏陽性菌,存在于土壤、水體、動(dòng)植物體內(nèi)[1]。近年來,國(guó)內(nèi)外研究人員相繼分離到不同的B.velezensis菌株,發(fā)現(xiàn)其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌及食品發(fā)酵等方面發(fā)揮良好作用,且對(duì)環(huán)境友好、易于人工培養(yǎng),在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用研究?jī)r(jià)值[2-5]。獲得高質(zhì)量總RNA 是進(jìn)行RT-PCR、qRT-PCR、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建、Northern 雜交、轉(zhuǎn)錄組和翻譯組測(cè)序等研究的基礎(chǔ)[6-8]。因此,高效、簡(jiǎn)便的B.velezensis總RNA提取方法對(duì)該菌的深入研究和利用至關(guān)重要。

    目前常見的細(xì)菌總RNA 提取方法有CTAB 法、強(qiáng)變性劑法、SDS-Phenol法及熱硼酸法等[7,9],這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn),并根據(jù)菌體特性適用于不同細(xì)菌類型。有效的細(xì)胞裂解是提取高產(chǎn)量細(xì)菌總RNA 的關(guān)鍵步驟。目前細(xì)菌細(xì)胞壁破碎的方法有酶解法、玻璃珠法和超聲波法[10-11]。相對(duì)于真核生物,細(xì)菌的RNA含量少,半衰期短,易降解;內(nèi)外環(huán)境以及操作體系無處不在的RNA 酶(RNase)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌總RNA提取效果不理想[7]。此外,破碎的細(xì)胞內(nèi)含物常與RNA 形成難溶的物質(zhì),導(dǎo)致RNA 難以分離。而國(guó)內(nèi)關(guān)于高質(zhì)量總RNA提取研究多集中于真核生物,尚缺乏高效、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的細(xì)菌高質(zhì)量總RNA提取方法。

    Trizol 法能夠快速高效分離不同的生物來源樣品的總RNA,所提取的總RNA 濃度和純度高,不需要超速離心或多步酚—氯仿進(jìn)行抽提[7]。然而,常規(guī)Trizol 法不能夠有效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁,且對(duì)RNase 的抑制效果并不理想,無法獲得高質(zhì)量的細(xì)菌總RNA[9]。因此,針對(duì)B.velezensis分泌蛋白量大且種類多、細(xì)胞壁厚等特點(diǎn),本研究通過優(yōu)化菌體培養(yǎng)條件、洗滌菌體次數(shù)、溶菌酶裂解細(xì)胞、液氮冷凍處理等方法,對(duì)傳統(tǒng)Trizol法進(jìn)行改良,獲得了高質(zhì)量的B.velezensis總RNA,為該菌的分子生物學(xué)研究提供了一種高效、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的總RNA提取技術(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株

    B.velezensis YQ1菌株由云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室分離鑒定并于-80℃中保存。

    1.1.2 主要試劑及儀器

    Trizol 試劑(Invitrogen,美國(guó)),0.1% DEPC水,溶菌酶(200 mg/mL)(Solarbio,北京),D 2 000 DNA Marker(天根,北京),RibopureTMBacteria kit(Invitrogen,美國(guó)),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermofisher,美國(guó))等。

    1.2 方法

    1.2.1 常規(guī)Trizol法

    (1)菌體培養(yǎng)及收集:將保存于-80℃的B.velezensis YQ1 菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng),30℃,180 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h。①固體培養(yǎng)條件菌體培養(yǎng)與收集:用接種環(huán)蘸取上述活化菌液在LB 固體培養(yǎng)基上劃線,30℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h 后,取50 mg 菌體至1.5 mL 離心管中。②液體培養(yǎng)條件菌體培養(yǎng)與收集培養(yǎng):將1 mL上述活化菌液加入200 mL LB 培養(yǎng)基中,30℃,180 r/min振蕩培養(yǎng),待OD600值達(dá)到1.0,8 000 g,4℃離心5 min,棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。

    (2)總RNA 提取步驟:①往上述離心管加入0.75 mL Trizol 試劑,移液器吸打混勻菌體,以最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩3~5 min;②室溫孵育5~10 min。加入0.2 mL 氯仿,上下顛倒混勻,室溫孵育2~3 min;③4℃、12 000 g 離心10 min;④吸取上清,加入等體積的異丙醇,上下顛倒混勻,置于20℃中冰凍10 min;⑤4℃、12 000 g 離心10 min;棄上清,加1 mL 75%乙醇,溫和振蕩5~10 s;⑥4℃、7 500 g 離心5 min;⑦棄上清,超級(jí)工作臺(tái)中晾置5~10 min 至乙醇完全揮發(fā);⑧加入30~50 μL DEPC水溶解,獲得的總RNA于-80℃冰箱保存。

    1.2.2 Trizol改良法

    (1)菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化:①固體培養(yǎng)條件下菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化:將活化菌液劃線至LB固體培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng)24、36和48 h,分別取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。②液體培養(yǎng)條件下菌液OD600值優(yōu)化:1 mL 活化的菌體加入200 mL LB 培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.5、1.0、1.5 和2.0 時(shí),8 000 g,4℃離心5 min,棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL 離心管中。

    (2)菌體DEPC 水處理:用25 mL 0.1%DEPC 水洗滌菌體,洗滌次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4 次,充分混勻菌體后,4℃,8 000 g離心5 min,棄上清后取50 mg菌體至1.5 mL離心管中。

    (3)溶菌酶處理:向最適DEPC 水處理后的菌體中加1 mL DEPC 水,混勻后分別加入20、30、40 μL 的溶菌酶,37℃靜置30 min,4℃、10 000 g 離心1 min,收集菌體。

    (4)液氮處理:將最適溶菌酶處理后的菌體置于1.5 mL離心管中,液氮冷凍2~3 min,未進(jìn)行液氮處理的菌體設(shè)置為對(duì)照。加入Trizol 試劑前將上述離心管取出后置于冰上融化。

    (5)總RNA 的提?。嚎俁NA 提取步驟同上述常規(guī)Trizol法總RNA提取步驟。

    1.2.3 改良Trizol法與試劑盒法的比較

    RibopureTMBacteria Kit 試劑盒總RNA 提 取 方法如下:取1 mL 菌液(OD600為1.0),將250 μL 氧化鋯珠滴入0.5 mL 的螺旋蓋中;離心收集樣品,加入350 μL RNAWTZ,渦旋振蕩均勻,將RNAWTZ中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到250 μL 的氧化鋯珠,擰緊蓋子,渦旋器中最大轉(zhuǎn)速振蕩10 min,充分溶解;4℃,14 000 g離心5 min;溶菌產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管,加入0.2 倍體積的氯仿,混勻,室溫孵育10 min;4℃、14 000 g 離心5 min;水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管,加0.5倍體積的無水乙醇,完全混合,將濾器放入2 mL 的收集管,將樣品轉(zhuǎn)移到濾器中;4℃、14 000 g 離心1 min;棄濾筒,濾器轉(zhuǎn)入新的 濾 筒,加700 μL Wash Solution 1;4℃、14 000 g 離心1 min;丟棄濾筒,過濾器放入收集管,加500 μL Wash Solution 2/3;4℃、14 000 g離心1 min;棄濾筒,過濾器放入收集管,重復(fù)上述步驟一次;4℃、14 000 g 離心1 min,轉(zhuǎn)移到2 mL的收集管;將預(yù)熱至95℃的25~50 μL洗脫液加到濾池中心;4℃、14 000 g 離心1 min;重復(fù)上述兩步一次,獲得的總RNA于-80℃冰箱保存。

    1.2.4 總RNA質(zhì)量及完整性檢測(cè)

    (1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):取總RNA 樣品4~5 μL,于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。200 V恒壓,16 min。凝膠成像儀上觀察條帶,并記錄結(jié)果。

    (2)RNA 純度和濃度檢測(cè):取2 μL 總RNA 樣品,用超微量紫外分光光度計(jì)(Thermofisher,美國(guó))分別檢測(cè)A260/A280、A260/A230及濃度(ng/μL)??俁NA 的A260/A280值為2.0 且A260/A230值 為2.0~2.5時(shí)為高純度總RNA。

    (3)cDNA 的合成和擴(kuò)增質(zhì)量鑒定:利用RTPCR 法對(duì)Trizol 改良法提取的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增質(zhì)量鑒定,以常規(guī)法提取的總RNA作為對(duì)照。根據(jù)Takara AMV (V 3.0) Reverse Transcriptase(Takara,大連)的說明進(jìn)行cDNA 第一鏈的合成和RT-PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 擴(kuò)增片段為B.velezensis16S rRNA片段,所用引物為(F:5’-CTTCGGGTGTTACAAACTCTCG-3’;R:5’-TAAGCCAATCCCACAAATCTG-3’),利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 常規(guī)Trizol法提取

    如圖1 所示, 常規(guī)Trizol 法提取的B.velezensis總RNA 存在明顯的降解,且A260/A280和A260/A230值均小于2.0(表1),說明有雜質(zhì)污染。推測(cè)培養(yǎng)基殘留,B.velezensis培養(yǎng)過程中分泌物多,菌體細(xì)胞壁未完全破裂,造成常規(guī)Trizol 法無法提取到該菌完整的總RNA。

    表1 常規(guī)Trizol法提取Bacillus velezensis總RNA的濃度和質(zhì)量

    2.2 Trizol改良法提取

    2.2.1B.velezensis培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    在進(jìn)行菌體培養(yǎng)時(shí),若B.velezensis生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期之前收集菌體,菌體量少;而進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,B.velezensis分泌大量的胞外酶(包括RNase),嚴(yán)重影響總RNA提取質(zhì)量。為明確菌體培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)B.velezensis總RNA 提取的影響,分別取LB 固體和液體培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體進(jìn)行總RNA提取。如圖2和表2所示,在LB固體培養(yǎng)基條件下,24 h的總RNA濃度和純度相對(duì)較高,說明在LB 固體培養(yǎng)基條件下,應(yīng)盡量選取24 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期)的菌體進(jìn)行總RNA 抽提。但24、36、48 h 總RNA 均有不同程度的降解,且A260/A280和A260/A230值均小于2.0(表2),說明有蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)污染。

    表2 LB固體培養(yǎng)基條件下不同培養(yǎng)時(shí)間B.velezensis總RNA的濃度和質(zhì)量

    如圖3 所示,在LB 液體培養(yǎng)基條件下當(dāng)菌體OD600值為1.0 和1.5 時(shí)能夠提取質(zhì)量較高的總RNA,但存在降解,且A260/A280和A260/A230值均小于2.0(表3),說明有蛋白、酚類、多糖等雜質(zhì)污染;而OD600值為0.5 和2.0 時(shí)總RNA 嚴(yán)重降解。說明在LB 液體培養(yǎng)基條件下,菌體培養(yǎng)至OD600值為1.0~1.5 時(shí)是最佳的總RNA提取時(shí)間。

    2.2.2 不同洗滌次數(shù)預(yù)處理對(duì)B.velezensis總RNA提取的影響

    表3 LB液體培養(yǎng)基條件下不同B.velezensis菌體OD600值的總RNA濃度和質(zhì)量

    收集菌體時(shí),殘留的培養(yǎng)基和菌體分泌物等對(duì)總RNA提取存在嚴(yán)重影響,因此本研究采用DEPC水洗滌菌體的方法來減少雜質(zhì)和RNase影響。為明確洗滌次數(shù)對(duì)減少雜質(zhì)和菌體分泌物的效果,分別對(duì)LB 液體培養(yǎng)基條件下收集的菌體(OD600值為1.0)進(jìn)行1、2、3、4次洗滌。如圖4和表4所示,洗滌2 次的B.velezensis總RNA 質(zhì)量較高,但均存在一定程度的降解。另外,DEPC 水洗滌處理后,總RNA濃度較低,不利于后續(xù)進(jìn)行RNA純化處理。

    表4 DEPC水洗滌處理后B.velezensis 總RNA的濃度和質(zhì)量

    2.2.3 溶菌酶處理對(duì)B.velezensis總RNA提取的影響

    為提高B.velezensis總RNA 提取量,需完全裂解菌體細(xì)胞壁,釋放核酸。本研究將上述DEPC水洗滌2次后的菌體,分別用20 μL(20 mg)、30 μL(30 mg)、40 μL(40 mg)溶菌酶處理菌體。如圖5和表5 所示,溶菌酶處理后,總RNA 濃度得到了明顯提高,30 μL(30 mg)溶菌酶處理后提取的總RNA質(zhì)量和濃度最高,但仍存在一定程度降解(表5)。說 明30 μL(30 mg) 溶 菌 酶 能 夠 完 全 裂 解B.velezensis(OD600值為1.0)細(xì)胞壁,保證高濃度的總RNA提取量。

    表5 溶菌酶處理后B.velezensis總RNA濃度和質(zhì)量

    2.2.4 液氮冷凍處理菌體對(duì)B.velezensis總RNA 提取的影響

    通過DEPC 水洗滌和溶菌酶處理后,提取的總RNA仍存在降解情況,說明B.velezensis體內(nèi)或提取過程中仍有RNAase 的影響。為抑制RNAase 活性,本研究對(duì)上述30 μL(30 mg)溶菌酶處理的菌體進(jìn)行液氮冷凍。如圖6 所示,提取菌體的總RNA可以清晰的看到23S、16S 和5S 條帶。相較于未進(jìn)行液氮處理的樣品,液氮處理后提取的總RNA降解程度少,并且濃度和純度高(表6),說明液氮處理能夠有效降低B.velezensis內(nèi)源性和提取過程中RNAase活性。

    2.3 Trizol改良法和試劑盒法比較

    表6 液氮冷凍處理提取B.velezensis總RNA的質(zhì)量和濃度比較

    由以上結(jié)果確定了B.velezensis總RNA Trizol改良法。為比較其與試劑盒法提取的總RNA效果,選取革蘭氏陽性菌總RNA提取試劑盒RibopureTMBacteria Kit。如圖7 所示,2 種方法均能獲得完整和高純度的總RNA,而Trizol法改良法提取的總RNA濃度更高,但相對(duì)于試劑盒法提取時(shí)間較長(zhǎng)(表7)。另外,試劑盒法提取的單個(gè)樣本總RNA價(jià)格比Trizol 改良法昂貴。因此Trizol 改良法適用于B.velezensis大批量樣本的總RNA 提取,而試劑盒法適用于小批量樣本的總RNA快速提取。

    2.4 RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)

    表7 Trizol改良法和試劑盒法提取的B.velezensis總RNA濃度和質(zhì)量

    以Trizol 常規(guī)法和改良法所提取的總RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。隨后以其為模板,利用B.velezensis16S rRNA的熒光定量PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,Trizol常規(guī)法提取的總RNA 無法擴(kuò)增出16S rRNA 片段,而Trizol 改良法提取的總RNA 能夠擴(kuò)增出明顯的16S rRNA 片段,且片段大小與預(yù)期相符(163 bp),說明Trizol 改良法提取的總RNA能夠滿足RT-PCR要求。

    3 討論與結(jié)論

    B.velezensis不僅具有富含肽聚糖的細(xì)胞壁,還具有強(qiáng)大的胞外酶分泌系統(tǒng),同時(shí)易產(chǎn)生內(nèi)源性RNase,這些特點(diǎn)加大了其總RNA提取難度[10-11]。貝萊斯芽孢桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,細(xì)胞分裂旺盛,胞內(nèi)活動(dòng)主要以細(xì)胞分裂相關(guān)為主,細(xì)胞壁積累較少,分泌物較少,易于破碎細(xì)胞并獲得高質(zhì)量的總RNA。由于常規(guī)Trizol 法無法提取到B.velezensis完整的總RNA,因此,本研究比較了不同培養(yǎng)條件下,不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)B.velezensis總RNA提取的影響,結(jié)果表明,LB液體培養(yǎng)條件下的B.velezensis總RNA 提取質(zhì) 量 較好,且OD600值 為1.0~1.5 是最佳提取時(shí)期。針對(duì)B.velezensis具有較強(qiáng)的胞外酶分泌系統(tǒng)特性,本研究通過DEPC水洗滌處理,在一定程度上減少了分泌物和殘留培養(yǎng)基的影響,與枯草芽孢桿菌總RNA提取方法的研究結(jié)果相符[12]。本研究通過加入適量溶菌酶裂解菌體,提高了總RNA濃度,但該方法并不適用于糞腸球菌和金黃色葡萄球菌[13-14],推測(cè)溶菌酶對(duì)不同革蘭氏陽性菌的裂解效率存在差異。另外,本研究通過對(duì)菌體液氮冷凍處理后發(fā)現(xiàn),液氮能夠抑制菌體破裂后的RNAase 活性,防止總RNA 在提取過程中的降解[10]。本研究還比較了Trizol 改良法與試劑盒提取B.velezensis總RNA 濃度效果,結(jié)果表明Trizol 改良法更加適合于大批量B.velezensis總RNA提取。

    本研究提供了一種簡(jiǎn)便有效的B.velezensis總RNA 提取方法,為滿足B.velezensis相關(guān)分子生物學(xué)研究提供了重要的技術(shù)支撐。

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