不同劑量濃度二陳湯對PCOS 模型大鼠性激素水平和卵巢形態(tài)學(xué)的影響

王維斌，張 萍，陳錦明，俞 潔

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡期婦女常見的生殖功能障礙和內(nèi)分泌代謝功能紊亂并見的復(fù)雜性疾病，臨床表現(xiàn)以卵巢多囊樣變、長期持續(xù)無排卵以及月經(jīng)不調(diào)、多毛、肥胖等癥狀為主。目前認(rèn)為下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能紊亂所導(dǎo)致的高雄激素血癥和高黃體生成素血癥，是導(dǎo)致PCOS 發(fā)生內(nèi)分泌功能紊亂的主要原因［1-2］。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于 PCOS 的治療多采用手術(shù)、促排卵、降低雄激素等對癥治療，通過改善臨床癥狀以提高生活質(zhì)量，但存在著毒副作用較大，容易復(fù)發(fā)的問題［3-4］。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：痰是導(dǎo)致 PCOS 發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，從痰論治PCOS 的理論依據(jù)由來已久［5-7］。 二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，是化痰的基礎(chǔ)方。 但由于人與大鼠在吸收中藥的效率和劑量濃度方面存在差異，適用于人體的藥物劑量濃度并不完全適用于大鼠。二甲雙胍是近年來臨床中治療 PCOS 的常用藥，療效頗受認(rèn)可［8］，因此，本研究通過設(shè)置低、中、高劑量二陳湯，以二甲雙胍作為陽性對照，探究二陳湯治療PCOS模型大鼠的最適劑量濃度， 為深入研究二陳湯治療PCOS 模型大鼠的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 21 日齡 SD 雌性大鼠 36 只，SPF級，體質(zhì)量（50±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供（許可證編號：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號：2015000558815），飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級屏障系統(tǒng)（許可證編號：SYXK（閩）2014-0005），飼養(yǎng)環(huán)境恒溫、恒濕，溫度（20±2）℃，濕度 40%～60%，12 h 周期性光照環(huán)境，普通飼料喂養(yǎng)（各成分熱量比例為：碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，包括纖維素在內(nèi)的其他成分8%），除實(shí)驗(yàn)期外自由飲食、飲水。本實(shí)驗(yàn)所有相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)操作都按照動物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2 試劑和藥物 二陳湯組方根據(jù)《太平惠民和劑局方》二陳湯的原方，處方：陳皮15 g，姜半夏15 g，茯苓9 g，炙甘草4.5 g。 由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科制備，嚴(yán)格按照2015 年版《中國藥典》規(guī)范，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：0.5 g/片，批號：AA20897）；脫氫表雄酮（DHEA，上海麥克林生化科技有限公司，批號：328C022）；注射用大豆油劑（上海源葉生物有限公司，規(guī)格：500 mL/瓶，批號：T15S9Z70260）；大鼠睪酮ELISA 試劑盒、大鼠黃體生成素ELISA 試劑盒、大鼠卵泡刺激素ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180727）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Premium U570 型超低溫冰箱、5424R 型微型冷凍離心機(jī)（美國Eppendorf 公司）；EG1150H 型生物組織包埋機(jī)、Histocore Pearl 型全封閉組織脫水機(jī)、RM2245 型石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Infinite M200 Pro 型多功能酶標(biāo)儀（奧地利 Tecan 公司）；Axio Imager A2 型顯微鏡（德國 Carl Zeiss 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立 參照張曉薇等［9］推薦的改良法，選取21 d 齡SD 雌性大鼠36 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d 后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組6 只和造模組30 只。 造模組將 DHEA 按 6 mg/100 g 體質(zhì)量溶于0.2 mL 注射用大豆油劑，每日進(jìn)行皮下注射于頸背部，連續(xù)20 d。正常組于頸背部皮下注射0.2 mL 注射用大豆油劑，連續(xù) 20 d。 于造模10 d 后，行兩個性周期（10 d）的大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察大鼠動情周期的變化，并定期觀察體質(zhì)量和攝食情況。

2.2 模型評價 造模第10 天開始觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞變化情況，連續(xù)觀察2 個周期。 正常組陰道涂片按照動情間期、動情前期、動情期、動情后期規(guī)律進(jìn)行；造模組陰道涂片則以黏液和白細(xì)胞為主，動情間期延長，失去規(guī)律動情周期。

2.3 分組及用藥治療 將成模后造模組30 只隨機(jī)分為模型組，二陳湯低、中、高劑量組（簡稱低、中、高劑量組），二甲雙胍組，每組6 只，并以正常組作為對照。 造模結(jié)束后開始灌胃給藥，按照人與動物劑量換算常規(guī)算法，即大鼠給藥劑量為人的6 倍計算用藥量，即為中劑量，而高劑量為中劑量的2 倍，低劑量為中劑量的1/2，據(jù)此換算出水煎液濃度。其中二陳湯低、中、高劑量組分別以2.175、4.350、8.700 g / （kg·d） ， 二 甲 雙 胍 組 給 予 二 甲 雙 胍0.3 g / （kg·d）灌胃 ，正常組 及 模 型組予 等體 積［10 mL /（kg·d）］滅菌飲用水灌胃。 各組分別連續(xù)干預(yù)4 周。

2.4 標(biāo)本取材及處理 于末次給藥當(dāng)日晚8 時開始禁食不禁水。 翌日稱重后，以10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉；待大鼠麻醉后，打開腹腔進(jìn)行腹主動脈采血，分離血清，用于性激素水平檢測；并分別完整取出雙側(cè)卵巢，剪去卵巢周圍脂肪組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈組織表面殘血，置于4%多聚甲醛內(nèi)，用于卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察。

3 指標(biāo)檢測

3.1 陰道脫落細(xì)胞涂片觀察 造模第10 天開始，每日早晨9∶00 進(jìn)行1 次陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察。 將無菌棉簽，浸于生理鹽水中，插入大鼠陰道約0.5 cm，稍旋轉(zhuǎn)，涂于玻片上，置于95%乙醇中濕固定15 min后取出，待自然風(fēng)干后，行蘇木素-伊紅（HE）染色并觀察。

3.2 性激素水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中睪酮（T）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。 檢測在多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)后顯色的深淺即吸光度值的大小，判斷標(biāo)本中待測抗體或抗原的濃度。

3.3 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 將置于4%多聚甲醛內(nèi)大鼠右側(cè)卵巢取出，流水沖洗6 h；選取卵巢的最大平面進(jìn)行石蠟包埋，蠟塊分別以4 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色并觀察。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。 計量資料符合正態(tài)分布的以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，多組間比較采用One-Way Anova 進(jìn)行統(tǒng)計處理；滿足方差齊性檢時，采用Least-SignificantDifference 方法；方差不齊時，采用 Dunnett T3 方法；不符合正態(tài)性分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

5 結(jié) 果

5.1 各組大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片變化 正常組連續(xù)4 d 陰道涂片按照動情間期、動情前期、動情期、動情后期規(guī)律進(jìn)行；造模組連續(xù)4 d 陰道涂片則以黏液和白細(xì)胞為主，動情間期延長，失去規(guī)律動情周期。 見圖 1。

圖1 大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片觀察（×10）

5.2 各組大鼠血清T、LH、FSH 水平比較 見表1。

表1 各組大鼠血清 T、LH、FSH 水平比較

表1 各組大鼠血清 T、LH、FSH 水平比較

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01；與二甲雙胍組比較，5） P＜0.05。

組別正 常 組模 型 組低劑量組中劑量組高劑量組二甲雙胍組n666666 T /（nmol/L）96.95±10.49 227.52±28.122）160.04±13.342）3）141.96±11.511）4）145.80±13.892）4）159.05±14.102）3）LH/（ng/L）26.22±3.27 44.18±3.352）41.35±2.562）37.87±2.692）3）5）40.89±4.092）37.42±5.862）3）FSH/（IU/L）20.86±2.24 28.55±1.602）25.34±1.661）3）22.58±1.524）5）22.93±1.614）5）26.72±3.922）

5.3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)HE 染色比較 正常組大鼠卵巢可見多個黃體及各級卵泡，顆粒細(xì)胞呈多層排列，形態(tài)完整，顆粒層多為8～9 層；模型組大鼠可見大量囊狀擴(kuò)張卵泡，卵巢顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，排列疏松，可見較多閉鎖卵泡，黃體少見；二陳湯低、中劑量組中可見囊狀卵泡數(shù)量減少，開始出現(xiàn)各級卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞層較模型組增厚，黃體增多，以二陳湯中劑量組與正常組較為接近；二陳湯高劑量組、二甲雙胍組仍可見大量囊狀擴(kuò)張卵泡及閉鎖卵泡，卵巢顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，排列疏松，與模型組無明顯差異。 見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)HE 染色比較（×50）

6 討 論

PCOS 根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多屬于“閉經(jīng)”“不孕”“癥瘕”“月經(jīng)后期”等病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，PCOS 發(fā)病與腎、肝、脾的功能密切相關(guān)［10］。 由于腎、肝、脾三臟功能失調(diào)，導(dǎo)致水液代謝障礙，引起痰濕壅塞，阻滯胞宮，阻礙排卵，使得卵巢增大，包膜增厚，從而導(dǎo)致PCOS 發(fā)生，痰濕是導(dǎo)致PCOS 發(fā)生和發(fā)展的重要病理因素。

二陳湯具有燥濕化痰，理氣健脾功效，是臨床治療PCOS 痰證的常用方劑，但是二陳湯治療PCOS的作用機(jī)制仍未明確。 本研究通過設(shè)置低、中、高劑量組的二陳湯，探究不同劑量濃度二陳湯治療PCOS 的作用機(jī)制，尋找二陳湯治療PCOS 模型大鼠的最適劑量濃度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：DHEA 誘導(dǎo)的PCOS 模型大鼠的 T、LH、FSH 激素水平上升，并且卵巢組織呈多囊樣變，符合PCOS 臨床癥狀表現(xiàn)，表明PCOS 模型大鼠建立成功。 經(jīng)過不同劑量濃度的二陳湯干預(yù)治療后，在性激素水平方面，其T、LH、FSH 激素水平均有所改善。 在卵巢形態(tài)學(xué)方面，二陳湯高劑量組及二甲雙胍組與模型組差異不大，而二陳湯低、中劑量組可對PCOS 卵巢形態(tài)學(xué)有明顯改善作用。 低、中、高劑量的二陳湯均可對PCOS 模型大鼠性激素水平與卵巢形態(tài)學(xué)有所改善， 說明了在PCOS 模型大鼠中存在有“痰”的病理因素，并且化痰法能夠改善PCOS 模型大鼠性激素水平及卵巢形態(tài)學(xué)變化。 本研究發(fā)現(xiàn)中劑量二陳湯相對于低、高劑量二陳湯在改善性激素水平及卵巢形態(tài)學(xué)方面療效更為明顯，說明了二陳湯中劑量是PCOS模型大鼠的最適劑量濃度，可以為后續(xù)深入研究二陳湯化痰治療PCOS 作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究存在樣本量較少的問題，后期可以提高樣本量進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，深入探討二陳湯改善PCOS 性激素水平及卵巢形態(tài)學(xué)變化的具體作用靶點(diǎn)，挖掘中藥化痰法治療PCOS 患者的分子生物學(xué)機(jī)制，為中醫(yī)化痰治療PCOS 提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。