肝細(xì)胞癌過(guò)繼細(xì)胞免疫治療研究進(jìn)展

李 艷， 嚴(yán)胡鈴， 石 瑛， 張 第， 黃孝倫

電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 細(xì)胞移植中心， 成都 610041

肝癌是全球最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]全球每年新增肝癌病例數(shù)84.1萬(wàn)人，肝癌相關(guān)死亡病例數(shù)78.2萬(wàn)人，其中約50%來(lái)自中國(guó)，極大的增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肝細(xì)胞癌(HCC)、膽管細(xì)胞癌以及兩者的混合型癌是原發(fā)性肝癌的三種主要常見(jiàn)類型，其中以HCC最為多發(fā)，大約占原發(fā)性肝癌的80%～90%。HCC的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，既往研究提示其致病因素包括病毒性肝炎、酒精性肝硬化、非酒精性脂肪性肝硬化等。目前針對(duì)HCC的臨床治療還是以手術(shù)切除為主，并根據(jù)患者病情考慮介入、消融、放療、化療等綜合治療方案。肝癌早期診斷的局限性和術(shù)后復(fù)發(fā)率高等因素都限制了肝癌切除術(shù)的臨床獲益。一項(xiàng)對(duì)1330例HCC患者手術(shù)切除治療后的跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，肝癌切除術(shù)后5年生存率為36.9%[2]；而其5年復(fù)發(fā)率卻高達(dá)70%[3]。因此，急需開(kāi)發(fā)新的個(gè)體化治療方案，以改善患者生存率。

近年來(lái)，隨著對(duì)肝癌組織結(jié)構(gòu)及免疫微環(huán)境認(rèn)知的深入，免疫治療逐漸成為HCC治療研究的熱點(diǎn)。腫瘤的免疫治療是指直接或間接調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺滅腫瘤細(xì)胞，根據(jù)其作用方式不同，可分為免疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)抑制劑、免疫疫苗以及過(guò)繼細(xì)胞免疫療法等。過(guò)繼細(xì)胞免疫治療是指通過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)具有腫瘤殺傷作用的免疫細(xì)胞，再將其回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)達(dá)到抗腫瘤目的的一種被動(dòng)免疫治療方法。根據(jù)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的靶向特異性不同可將其分為非特異性腫瘤殺傷免疫細(xì)胞和特異性腫瘤殺傷免疫細(xì)胞。具有非特異性腫瘤殺傷作用的免疫細(xì)胞包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK)和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)；而具有特異性腫瘤殺傷作用的免疫細(xì)胞包括樹(shù)突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(dendritic cells and cytokine-induced killer cells，DC-CIK)、腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)以及嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T)。本文就這幾種過(guò)繼免疫細(xì)胞治療HCC的研究現(xiàn)狀及臨床研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述。

1 非特異性腫瘤殺傷免疫細(xì)胞

1.1 細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK) CIK是通過(guò)細(xì)胞因子體外刺激外周單核細(xì)胞擴(kuò)增而得到的一類異質(zhì)性混合淋巴細(xì)胞群，主要包括NK樣T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞[4]。NKT細(xì)胞是發(fā)揮抗腫瘤活性的主要效應(yīng)細(xì)胞，作為固有免疫應(yīng)答中的一員，其主要是通過(guò)釋放細(xì)胞因子或激活Fas/FasL、NKG2D等途徑發(fā)揮非特異性腫瘤殺傷作用。NKT細(xì)胞在外周單核細(xì)胞中占比較少，但在經(jīng)體外細(xì)胞因子刺激后可擴(kuò)增到原來(lái)的1000倍左右[5]，這就增加了CIK過(guò)繼免疫治療的可行性。最新研究[6]指出CIK中NKT細(xì)胞占比可作為預(yù)測(cè)CIK治療肝切除術(shù)后HCC患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

鑒于CIK的廣譜抗腫瘤特性，其已被廣泛研究用于治療臨床腫瘤患者。目前，已有許多臨床試驗(yàn)證明CIK過(guò)繼細(xì)胞免疫治療在晚期或一線治療無(wú)效的腫瘤患者中的可行性和有效性。一項(xiàng)多中心Ⅲ期臨床試驗(yàn)[7]結(jié)果表明，CIK治療能將HCC患者的無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)至44個(gè)月，隨后的5年隨訪結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組(未經(jīng)CIK輔助治療)，HCC患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期都得到了有效延長(zhǎng)[8]。然而，近期一項(xiàng)臨床研究[9]報(bào)道卻指出CIK治療在改善HCC患者無(wú)進(jìn)展生存期的同時(shí)并沒(méi)有明顯提高患者的總生存期。而導(dǎo)致該矛盾產(chǎn)生的原因除了各自臨床設(shè)計(jì)以及患者納入標(biāo)準(zhǔn)等有所不同以外，基于其分子機(jī)制，一方面由于CIK是通過(guò)細(xì)胞因子刺激外周單核細(xì)胞而得到的，不具備腫瘤特異性靶向殺傷作用，抗腫瘤活性較弱；另一方面則是因?yàn)楦闻K“免疫特赦”的特點(diǎn)，HCC患者的腫瘤免疫微環(huán)境處于抑制狀態(tài)，使回輸?shù)腃IK耗損較多。Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CIK能增加腫瘤中免疫抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而抑制CIK自身的抗腫瘤活性。由此可見(jiàn)，CIK治療并不能使所有的HCC患者從中獲益。

基于以上研究結(jié)果，將CIK與其他治療方法聯(lián)用可能有助于增強(qiáng)CIK療法的有效性。I125放射粒子植入是腫瘤放射治療的一種方法，其可以達(dá)到局部殺傷腫瘤的效果。CIK聯(lián)合I125放射粒子植入治療肝癌小鼠的研究[11]表明，聯(lián)合治療能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。免疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)抑制劑通過(guò)阻斷免疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)信號(hào)通路來(lái)阻止腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，增加免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別及殺傷作用。Huang等[12]通過(guò)降低肝癌細(xì)胞中程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)表達(dá)可以改善CIK對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性，增加其抗腫瘤活性。由此可見(jiàn)，未來(lái)CIK免疫治療HCC的臨床研究重點(diǎn)可轉(zhuǎn)向聯(lián)合治療，有望使更多的HCC患者從中獲益。

1.2 NK細(xì)胞 NK細(xì)胞是人體固有免疫中最重要的免疫細(xì)胞之一，其可以在不受抗原致敏的情況下發(fā)生非特異性免疫應(yīng)答。NK細(xì)胞的活化狀態(tài)由NK細(xì)胞表面抑制性受體(NKG2A、KIR、LIR-1等)和活化性受體(NKG2D、NKp30、NKp80等)表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡決定。根據(jù)NK細(xì)胞表面CD56表達(dá)表型不同將其分為CD56DimNK和CD56BirghtNK細(xì)胞，外周循環(huán)中90%的NK細(xì)胞都是CD56BirghtNK細(xì)胞，主要通過(guò)細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞；而CD56DimNK細(xì)胞主要存在于組織中，通過(guò)釋放細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能發(fā)揮間接抗腫瘤效應(yīng)。肝臟是人體NK細(xì)胞最大的儲(chǔ)存場(chǎng)所，但肝癌中的NK細(xì)胞由于免疫抑制微環(huán)境往往處于功能性衰竭狀態(tài)，最近有研究[13]指出，去乙?；?2能重新激活肝癌小鼠腫瘤中衰竭NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。因此，通過(guò)外源加入具有抗腫瘤活性的NK細(xì)胞，重塑肝臟的免疫系統(tǒng)，有望延緩肝癌患者的生存時(shí)間。

NK細(xì)胞的免疫活性并不受主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制，因此用于過(guò)繼免疫治療的NK細(xì)胞來(lái)源較廣。根據(jù)NK細(xì)胞來(lái)源可將NK細(xì)胞過(guò)繼免疫療法分為自體NK細(xì)胞免疫療法和同種異體NK細(xì)胞(CD34+造血干細(xì)胞、NK92細(xì)胞等)免疫療法。自體NK過(guò)繼免疫細(xì)胞是用細(xì)胞因子刺激外周單核細(xì)胞中CD56BirghtNK細(xì)胞的體外擴(kuò)增得到的，研究[14]發(fā)現(xiàn)經(jīng)細(xì)胞因子刺激后能將外周血中NK細(xì)胞擴(kuò)增到原來(lái)的140倍左右，并表現(xiàn)出對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。Parkhurst等[15]首次將自體NK細(xì)胞用于治療8例晚期黑色素瘤和腎癌患者的臨床研究結(jié)果表明，NK細(xì)胞可在腫瘤患者外周中持續(xù)停留1個(gè)月之久，但并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的臨床療效；隨后的一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究結(jié)果也表明自體NK細(xì)胞的臨床療效甚微[16]。從分子水平上分析，腫瘤細(xì)胞表面往往高表達(dá)與自身NK細(xì)胞表面相匹配的NK細(xì)胞表面抑制性受體(inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)使腫瘤細(xì)胞極易發(fā)生免疫逃逸。由此便促進(jìn)了同種異體NK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的發(fā)展。Miller等[17]通過(guò)腫瘤細(xì)胞表面和同種異體NK細(xì)胞表面KIR的不同匹配程度預(yù)測(cè)NK細(xì)胞的臨床療效，結(jié)果顯示，在KIR不匹配的腫瘤患者中有75%獲得了完全緩解；而在KIR匹配的情況下，只有13.3%的患者獲得了完全緩解，說(shuō)明與腫瘤KIR受體不匹配的同種異體NK細(xì)胞具有更好的臨床療效。一項(xiàng)針對(duì)KIR錯(cuò)配的同種異體NK細(xì)胞治療HCC的臨床結(jié)果初步提示NK細(xì)胞能在短期內(nèi)提高HCC患者的免疫功能，改善患者的生活質(zhì)量[18]。

以上的研究結(jié)果表明，具有廣譜抗腫瘤效應(yīng)的NK細(xì)胞只能在短期內(nèi)使部分HCC患者從中受益。一方面，NK細(xì)胞缺乏有效的腫瘤特異性靶向作用，抗腫瘤活性弱；其次，肝癌的免疫抑制微環(huán)境抑制了回輸?shù)腘K細(xì)胞的免疫活性。據(jù)此，有臨床研究將同種異體NK細(xì)胞免疫治療和其他肝癌治療方法聯(lián)用以期加強(qiáng)NK細(xì)胞免疫治療的臨床療效。不可逆電穿孔技術(shù)是一種創(chuàng)傷小、周期短的腫瘤治療方法，研究[19]發(fā)現(xiàn)，不可逆電穿孔技術(shù)和同種異體NK細(xì)胞聯(lián)合治療能有效改善晚期HCC患者的免疫狀態(tài)，延長(zhǎng)患者的無(wú)疾病進(jìn)展期和總生存期。最近1例個(gè)案報(bào)告[20]在HCC患者接受肝移植后復(fù)發(fā)的情況下，采用同種異體NK細(xì)胞聯(lián)合I125粒子植入治療有效地改善了該例患者的肝功能，明顯觀察到了腫瘤的消退。以上結(jié)果均提示NK細(xì)胞的聯(lián)合治療有望使更多的HCC患者從中受益。

2 特異性腫瘤殺傷免疫細(xì)胞

2.1 樹(shù)突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK) 作為抗原遞呈能力最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，DC細(xì)胞通過(guò)識(shí)別、加工腫瘤抗原，形成抗原-MHC復(fù)合物表達(dá)于細(xì)胞表面供T淋巴細(xì)胞識(shí)別，促進(jìn)幼稚T淋巴細(xì)胞成熟。研究表明，肝癌免疫抑制微環(huán)境中的DC細(xì)胞處于功能性耗竭狀態(tài)。因此，有研究人員提出將負(fù)載有腫瘤抗原的DC細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，補(bǔ)充肝癌中功能性耗竭的DC細(xì)胞，重新激活肝癌中的免疫細(xì)胞以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。但臨床研究[21]結(jié)果顯示，與對(duì)照組(接受支持治療)相比，DC細(xì)胞只能使13%的晚期HCC患者獲得部分緩解，可見(jiàn)其臨床療效甚微。究其原因，可能是肝癌中T淋巴細(xì)胞活性處于被抑制的狀態(tài)，難以在免疫抑制微環(huán)境下被重新激活。DC細(xì)胞治療的局限性進(jìn)一步促進(jìn)了DC-CIK治療的研究。一方面，DC細(xì)胞可通過(guò)將腫瘤抗原遞呈給CIK，促進(jìn)CIK成熟，增加其腫瘤特異性靶向殺傷作用；另一方面，DC細(xì)胞本身就可釋放細(xì)胞因子發(fā)揮間接的抗腫瘤效應(yīng)。DC-CIK治療肝癌小鼠的初步研究[22]結(jié)果證明其能增加體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

隨著對(duì)DC-CIK抗腫瘤活性基礎(chǔ)研究的深入，DC-CIK過(guò)繼免疫治療HCC的研究逐漸轉(zhuǎn)向臨床。近期一項(xiàng)Meta分析[23]比較了DC細(xì)胞、CIK和DC-CIK治療晚期HCC患者的臨床療效，發(fā)現(xiàn)DC-CIK治療HCC患者的總生存期高于DC細(xì)胞和CIK單獨(dú)治療。但由于肝癌的免疫抑制微環(huán)境，DC-CIK的免疫活性部分被抑制而導(dǎo)致其遠(yuǎn)期療效有限，基于此，目前有更多的臨床研究嘗試將DC-CIK免疫治療同其他腫瘤治療方法聯(lián)合，以期通過(guò)改善肝癌的免疫抑制微環(huán)境增加DC-CIK的抗腫瘤活性。索拉非尼是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于HCC治療的一線靶向藥，據(jù)一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)[24]結(jié)果表明，索拉非尼能將HCC患者的中位生存時(shí)間延長(zhǎng)至12.3個(gè)月，但隨后的研究表明索拉非尼在短期內(nèi)極易產(chǎn)生耐藥。Zhou等[25]將索拉非尼聯(lián)合DC-CIK過(guò)繼免疫治療晚期HCC患者，與單獨(dú)治療相比，聯(lián)合治療將HCC患者的中位生存時(shí)間延長(zhǎng)了約5個(gè)月。經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)是不能手術(shù)切除的中晚期HCC患者或術(shù)后進(jìn)行輔助治療的一種常用介入治療方法，其副作用的病死率極高，同時(shí)難以達(dá)到全身性治療效果而限制了其在HCC治療中的廣泛應(yīng)用。對(duì)接受過(guò)TACE治療的HCC患者輔以DC-CIK治療的臨床研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，DC-CIK治療組患者的無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率均高于單獨(dú)TACE治療組[26]；同時(shí)，有研究[27]指出DC-CIK對(duì)PD-L1低表達(dá)并接受過(guò)TACE治療的HCC患者治療效果最佳，提示PD-L1可能作為預(yù)測(cè)接受過(guò)TACE治療后再行DC-CIK治療臨床療效的關(guān)鍵因子。HBV感染是HCC發(fā)展過(guò)程中的主要危險(xiǎn)因素，因此有效預(yù)防HBV感染可以降低HCC的發(fā)病率。將負(fù)載有HBsAg的DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后用于治療慢性乙型肝炎，能有效降低患者HBV病毒滴度，提高宿主對(duì)病毒的免疫應(yīng)答，提示HBsAg-DC-CIK治療能增強(qiáng)乙型肝炎患者的免疫功能，預(yù)防HCC的發(fā)生[28]。另一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證明DC-CIK治療后約57%的HCC患者體內(nèi)HBV病毒載量都有所降低[29]。以上臨床研究結(jié)果表明DC-CIK在抑制肝癌生長(zhǎng)的同時(shí)還能降低肝癌患者體內(nèi)HBV病毒滴度，有望降低HCC的復(fù)發(fā)率。但后續(xù)仍然需要更多的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證明其臨床有效性和安全性。

2.2 腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(TIL) 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞是存在于腫瘤間質(zhì)中的一類異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群，包括CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及各種免疫抑制細(xì)胞如：調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞等。TIL過(guò)繼免疫療法即是通過(guò)細(xì)胞因子刺激經(jīng)腫瘤組織“馴化”后具有特異性抗腫瘤活性的CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞在體外的克隆性增殖，再回輸給腫瘤患者體內(nèi)，被動(dòng)增強(qiáng)腫瘤患者免疫功能的一種治療方法，其中以發(fā)揮主要抗腫瘤效應(yīng)的CD8+T淋巴細(xì)胞居多[30]。CD8+T淋巴細(xì)胞可通過(guò)其表面T淋巴細(xì)胞抗原受體與腫瘤抗原識(shí)別而釋放顆粒酶、激活Fas/FasL途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，或通過(guò)釋放細(xì)胞因子等發(fā)揮直接或間接的抗腫瘤效應(yīng)；而CD4+T淋巴細(xì)胞則在促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞成熟的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

由于不同腫瘤組織結(jié)構(gòu)不同，分離擴(kuò)增TIL的難易程度也不同。通過(guò)比較黑色素瘤不同轉(zhuǎn)移部位的腫瘤組織中TIL分離的難易程度發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移來(lái)源的腫瘤組織分離擴(kuò)增出TIL的成功率最高[31]。分離TIL的常規(guī)步驟包括：(1)TIL初次擴(kuò)增階段，將腫瘤組織剪成碎片，加入含有IL-2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板中，大約2～4周即可收集細(xì)胞；(2)TIL快速擴(kuò)增階段，收集第一個(gè)擴(kuò)增階段中聚集生長(zhǎng)的TIL培養(yǎng)于含有IL-2、抗CD3單抗的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次擴(kuò)增，約14 d后收集細(xì)胞。常規(guī)方法分離擴(kuò)增TIL的成功率并不高，不能在短期內(nèi)使TIL數(shù)量達(dá)到臨床數(shù)量級(jí)。研究[32]表明，生物反應(yīng)器可以實(shí)現(xiàn)體外大量TIL的擴(kuò)增，但并不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有條件使用生物反應(yīng)器。隨后，有研究[33]通過(guò)對(duì)普通培養(yǎng)瓶結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，制得的G-Rex透氣培養(yǎng)瓶能使細(xì)胞更好的利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減少有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷，實(shí)現(xiàn)了在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得臨床數(shù)量級(jí)TIL的目的，目前該透氣瓶已廣泛應(yīng)用于TIL等免疫細(xì)胞的體外大量擴(kuò)增。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明，TIL能分泌高水平IFNγ、IL-2等細(xì)胞因子[34]，通過(guò)瘤內(nèi)注射TIL可使荷瘤小鼠緩解率達(dá)到40%[35]。但自從1986年Rosenberg等[36]首次報(bào)道提出從腫瘤組織中分離擴(kuò)增的TIL具有抗腫瘤活性以來(lái)，大部分臨床研究均圍繞黑色素瘤展開(kāi)。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)對(duì)22例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者行自體TIL治療后有35%的患者出現(xiàn)客觀緩解，其中1例發(fā)生廣泛肝轉(zhuǎn)移的患者在治療后完全緩解時(shí)間達(dá)21個(gè)月以上[37]，近期的一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果也表明自體TIL能將轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的總體中位生存時(shí)間延長(zhǎng)至6.2個(gè)月[38]。相比之下，TIL應(yīng)用于HCC中的臨床研究則較少。一方面可能由于肝臟組織結(jié)構(gòu)較為緊密，分離擴(kuò)增TIL難度相對(duì)較大；另一方面，HCC腫瘤免疫抑制微環(huán)境削弱了部分TIL的抗腫瘤活性。一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)[39]將自體TIL應(yīng)用于治療8例經(jīng)手術(shù)切除治療后的HCC患者，持續(xù)給予細(xì)胞治療16個(gè)月，其中只有1例(12.5%)復(fù)發(fā)，與對(duì)照組(未給予TIL治療或其他免疫治療)6、12個(gè)月的復(fù)發(fā)率(19%、42%)相比，TIL治療明顯降低了HCC患者手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)率。以上的臨床結(jié)果初步顯示了TIL治療HCC的臨床有效性，后續(xù)可著眼于改變HCC腫瘤免疫抑制微環(huán)境及TIL分離擴(kuò)增方法的優(yōu)化，以期能讓更多的HCC患者從中獲益。

2.3 嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞(CAR-T) CAR-T是將靶向特異性腫瘤抗原單抗的scFv段與CD3基因序列重組并導(dǎo)入T淋巴細(xì)胞中形成具有腫瘤特異性靶向殺傷作用的免疫細(xì)胞，并通過(guò)其scFv段與腫瘤抗原識(shí)別，誘導(dǎo)胞內(nèi)CD3激活，刺激T淋巴細(xì)胞釋放炎性因子等實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的特異性殺傷作用。CAR-T發(fā)展至今共經(jīng)歷了四代：第一代是將腫瘤抗原單抗的scFv段與CD3基因序列重組形成的CAR-T；第二代CAR-T是在第一代基礎(chǔ)上增加了共刺激信號(hào)CD28的表達(dá)，其抗腫瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于第一代；第三代CAR-T則增加了兩個(gè)或兩個(gè)以上共刺激信號(hào)表達(dá)，其抗腫瘤效應(yīng)和細(xì)胞增殖能力都有所提高，但其毒副作用也在增加；第四代CAR-T則是增加了細(xì)胞因子的共表達(dá)，進(jìn)一步強(qiáng)化了CAR-T的免疫應(yīng)答。

影響CAR-T治療的關(guān)鍵因素是腫瘤抗原的選擇，靶向的腫瘤抗原需要具有腫瘤特異性以達(dá)到靶向殺傷腫瘤的目的。目前靶向HCC的腫瘤抗原有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、甲胎蛋白(AFP)、CD147、癌胚抗原，其中以GPC3研究最多。GPC3是錨定于細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，GPC3在HCC中特異性高表達(dá)使其成為HCC治療的理想靶點(diǎn)。Gao等[40]首次評(píng)估了Anti-GPC3 CAR-T細(xì)胞對(duì)GPC3表達(dá)不同的肝癌細(xì)胞的殺傷能力，結(jié)果表明其能有效殺傷GPC3+的肝癌細(xì)胞，且其抗腫瘤效應(yīng)與GPC3表達(dá)量呈正比，隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明其對(duì)原代肝癌組織的抗腫瘤活性[41]。肝癌免疫抑制微環(huán)境中免疫抑制因素的存在可能會(huì)削弱CAR-T的抗腫瘤活性，如：PD-1/PD-L1信號(hào)通路等。研究通過(guò)在CAR結(jié)構(gòu)中增加抗PD-1單抗的表達(dá)[42]或運(yùn)用CRISPR/CAS9技術(shù)敲除受體T淋巴細(xì)胞中PD-1的表達(dá)[43]阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路均能增加Anti-GPC3 CAR-T對(duì)GPC3+/PD-L1+肝癌細(xì)胞的抗瘤活性。通過(guò)在CAR重組基因中增加細(xì)胞因子的表達(dá)，不僅能促進(jìn)CAR-T的成熟，增加其抗腫瘤活性，還能發(fā)揮細(xì)胞因子本身的免疫調(diào)節(jié)功能，達(dá)到雙重抗腫瘤的效果。近期Liu等[44]在Anti-GPC3 CAR-T中增加IL-12的表達(dá)不僅能有效裂解GPC3+的肝癌細(xì)胞，還能抑制荷瘤小鼠中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的免疫活性。Batra等[45]通過(guò)在CAR結(jié)構(gòu)中增加細(xì)胞因子IL-15和IL-21的表達(dá)，能刺激CAR-T在體內(nèi)外的快速增殖，使其在動(dòng)物體內(nèi)具有強(qiáng)而持久的抗腫瘤效應(yīng)，這為開(kāi)展共表達(dá)IL-15和IL-21的Anti-GPC3 CAR-T細(xì)胞治療HCC的臨床研究提供了理論基礎(chǔ)，目前該項(xiàng)研究已成功申請(qǐng)了Ⅰ期臨床試驗(yàn)(NCT04093648)。2018年在Nature上發(fā)表的一篇研究[46]通過(guò)在CAR-T中增加細(xì)胞因子IL-7和CCL19的表達(dá)，能增加DC細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)，間接增強(qiáng)CAR-T的抗腫瘤活性，隨后該研究的有效性也在肝癌細(xì)胞中得到了證實(shí)[47]。目前Anti-GPC3 CAR-T治療HCC的研究還僅限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但已有多項(xiàng)Anti-GPC3 CAR-T治療HCC的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在研究當(dāng)中(表1)。

表1 靶向GPC3的CAR-T治療HCC的臨床研究

AFP的異常表達(dá)是作為診斷HCC的常用生化指標(biāo)。與GPC3不同，AFP是一種胞內(nèi)合成的分泌蛋白，不表達(dá)于細(xì)胞膜上，無(wú)法實(shí)現(xiàn)抗體與腫瘤抗原的直接識(shí)別，限制了其在作為靶向抗原治療HCC中的應(yīng)用。因此Liu等[48]將MHC-AFP作為CAR-T的靶向抗原，經(jīng)瘤內(nèi)注射后約有75%的肝癌小鼠腫瘤出現(xiàn)完全消退。目前有關(guān)CAR-T的臨床研究仍以惡性血液類腫瘤居多，近期一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗(yàn)共納入15例淋巴瘤和白血病患者，其中有6例(40%)在經(jīng)自體Anti-CD19 CAR-T治療后出現(xiàn)完全緩解[49]，證明了Anti-CD19 CAR-T治療血液類惡性腫瘤的臨床可行性和安全性。且美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)自體Anti-CD19 CAR-T用于臨床治療急性粒細(xì)胞白血病[50]。而對(duì)于HCC而言，由于強(qiáng)免疫抑制微環(huán)境，特異性腫瘤抗原缺乏等原因都限制了CAR-T在HCC治療中的臨床獲益。因此還需要不斷對(duì)肝癌的免疫抑制微環(huán)境機(jī)制進(jìn)行深入探討，尋找肝癌特異性更強(qiáng)的靶點(diǎn)，以期使HCC患者也能從CAR-T治療中獲益。

3 小結(jié)

用于過(guò)繼免疫治療的免疫細(xì)胞都具有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)(表2)。盡管過(guò)繼細(xì)胞免疫治療在HCC的治療方面展現(xiàn)出了巨大的潛能，但目前仍然有許多問(wèn)題亟待解決：(1)HCC中強(qiáng)免疫抑制微環(huán)境往往會(huì)削弱過(guò)繼免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性；(2)制備過(guò)繼免疫細(xì)胞的周期較長(zhǎng)，難以在短時(shí)間內(nèi)獲得臨床數(shù)量級(jí)的免疫細(xì)胞；(3)回輸?shù)募?xì)胞量以及各種質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)統(tǒng)一的規(guī)范等。因此如何在體外通過(guò)更簡(jiǎn)單的方法在短時(shí)間內(nèi)獲得臨床數(shù)量級(jí)具有特異性腫瘤殺傷效應(yīng)的免疫細(xì)胞將是今后HCC過(guò)繼細(xì)胞免疫治療研究的重點(diǎn)方向。相信在不久的將來(lái)，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療將成為臨床上HCC治療可供選擇的另一方法。

表2 用于過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的免疫細(xì)胞在HCC治療中的優(yōu)缺點(diǎn)