急性肝衰竭犬模型肝細(xì)胞膜表面OATP1及MRP2蛋白表達(dá)與釓塞酸二鈉增強(qiáng)MRI信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)性分析

王 昊， 陳 好， 歐陽(yáng)中敏， 劉志強(qiáng)

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 a.消化內(nèi)科； b. 影像科， 廣州 510700

急性肝衰竭(ALF) 是由多種因素所致肝臟的合成、解毒、排泄以及生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生失代償或引發(fā)嚴(yán)重的器官功能衰竭的臨床癥候群，病死率高達(dá)70%～80%[1]。新型造影劑釓塞酸二鈉(Gd-EOB-DTPA)行MRI增強(qiáng)掃描作為節(jié)段性評(píng)估肝功能的方法是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[2-3]。筆者前期通過(guò)對(duì)CCl4誘導(dǎo)建立的犬類(lèi)ALF模型行Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI掃描，探索不同時(shí)期感興趣區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度與肝細(xì)胞病理及細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)20 min為肝細(xì)胞最佳成像時(shí)間，且增強(qiáng)掃描后信號(hào)強(qiáng)度越低，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重[4]。由此推測(cè)Gd-EOB-DTPA行MRI增強(qiáng)掃描也可以節(jié)段性評(píng)估ALF患者的肝功能。已知有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽1(organic anion transporting polypep tide 1，OATP1)能夠介導(dǎo)肝細(xì)胞對(duì)Gd-EOB-DTPA的攝取，而多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)則介導(dǎo)Gd-EOB-DTPA經(jīng)膽汁排泄[5]。因此，本研究進(jìn)一步探討ALF Beagle犬在Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI注射造影劑20 min時(shí)不同信號(hào)區(qū)的肝臟信號(hào)強(qiáng)度與跨膜蛋白OATP1及MRP2表達(dá)變化的相關(guān)性，以期得出一個(gè)能從節(jié)段性水平快速評(píng)估ALF時(shí)肝功能的方法，目的是建立一個(gè)具有分子生物學(xué)層面評(píng)估肝細(xì)胞功能的ALF犬模型，為優(yōu)化治療方案提出依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物誘導(dǎo)ALF犬模型建立 選取10～12月齡健康成年雄性Beagle犬16只[購(gòu)自福州振和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(閩2012-0002)，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(閩2018-0001)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(粵2012-0117)]。體質(zhì)量約(13.0±3.0)kg，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組，n=8)和ALF組(B組，n=8)。采用乙酰氨基酚聯(lián)合CCl4誘導(dǎo)ALF的方法進(jìn)行造模，具體方法參照前期研究方案[6]。

1.2 Beagle犬采用Gd-EOB-DTPA進(jìn)行MRI增強(qiáng)平掃 造模24 h，采用犬眠寶0.06 ml/kg肌肉注射對(duì)Beagle犬進(jìn)行全身麻醉，麻醉前15 min皮下注射硫酸阿托品(浙江浙北藥業(yè)有限公司)1 ml預(yù)防誤吸。將麻醉后的Beagle犬固定在磁共振檢查床上，每條Beagle犬采用1.5T核磁共振成像儀進(jìn)行MRI平掃，掃描前禁食禁水6～8 h;掃描序列包括T1WI同反相位(矩陣208×256，重復(fù)時(shí)間110.0 ms，回波時(shí)間2.38 ms、4.76ms)、T1WI(矩陣188×256，重復(fù)時(shí)間169.0 ms，回波時(shí)間4.76 ms)、T2WI(矩陣320×320，重復(fù)時(shí)間2200.0 ms，回波時(shí)間90.0 ms)。掃描范圍為橫隔頂至肝臟下緣;掃描體位為俯臥位。采用8通道相控陣體部線(xiàn)圈。掃描視野為130×320 mm，反轉(zhuǎn)角度10°，獲得時(shí)間16 s。

平掃結(jié)束后注射對(duì)比劑Gd-EOB-DTPA(商品名“普美顯”P(pán)rimovist，拜耳先靈醫(yī)藥，德國(guó))，注射劑量為0.1 ml/kg，人工靜脈推注，流率為2 ml/s。注射對(duì)比劑后用10 ml生理鹽水進(jìn)行沖洗，沖洗流率為2 ml/s。

Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI掃描：動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描序列使用3D擾相容積序列的脂肪抑制T1加權(quán)梯度回波影像，延遲20 min掃描為肝細(xì)胞期，掃描序列為FS 3D(矩陣130×320，重復(fù)時(shí)4.08 ms，回波時(shí)間1.65 ms，層厚3 mm，層間距0)。肝臟MRI檢查結(jié)束后，將數(shù)據(jù)傳輸?shù)焦ぷ髡尽?/p>

1.3 MRI增強(qiáng)掃描前后數(shù)據(jù)測(cè)定 選擇1名具有10年工作經(jīng)驗(yàn)且經(jīng)倫理委員會(huì)認(rèn)證的腹部放射科醫(yī)師，根據(jù)B組在注射Gd-EOB-DTPA 20 min后所獲得的圖像判斷是否存在不同增強(qiáng)程度的區(qū)域，以正常A組肝臟T1W1信號(hào)強(qiáng)度作為參照，B組分別于MRI增強(qiáng)掃描前及20 min后于肝臟同一軸向?qū)用娉尸F(xiàn)高、中、低不同信號(hào)區(qū)域。避開(kāi)肉眼可見(jiàn)的膽管及血管，分別選擇兩組在MRI增強(qiáng)掃描前、增強(qiáng)掃描20 min時(shí)肉眼所見(jiàn)的不同增強(qiáng)程度區(qū)域作為感興趣區(qū)域(直徑約3～6 mm)，測(cè)量該區(qū)域?qū)?yīng)的信號(hào)強(qiáng)度(signal intensity，SI)，每個(gè)感興趣區(qū)測(cè)量3次。首過(guò)快速上升期中的增強(qiáng)斜率百分比計(jì)算公式：(SImax-SIbase/ SIbase×△t)×100%。

SImax指時(shí)間-信號(hào)曲線(xiàn)首過(guò)灌注肝臟所達(dá)到的最大值，SIbase指造影劑增強(qiáng)掃描后進(jìn)入動(dòng)脈期前最先獲得的兩幅圖像中所得的平均信號(hào)值。△t指從SIbase至SI1st的時(shí)間間隔[7]。該數(shù)據(jù)由后處理工作站上的特定軟件(Mean Curve，Syngo MR D13，SiemensHealthcare)進(jìn)行分析。通過(guò)軟件計(jì)算得出兩組不同信號(hào)值的時(shí)間-信號(hào)曲線(xiàn)。

1.4 MRI定位下穿刺 B組根據(jù)注射造影劑Gd-EOB-DTPA后20 min(肝細(xì)胞期)的MRI圖像選擇同一軸向?qū)用娴母?、中、低不同信?hào)區(qū)作為感興趣區(qū)域進(jìn)行肝穿刺。A組選擇Gd-EOB-DTPA行MRI增強(qiáng)掃描后在相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行肝穿刺。使用一次性活檢針(巴德醫(yī)療科技上海有限公司代理)進(jìn)行肝穿刺活檢，穿刺時(shí)注意避開(kāi)肉眼所見(jiàn)血管、膽管、病灶。每個(gè)感興趣區(qū)均取1份約0.1 g的肝組織，用于Western Blot法檢測(cè)跨膜蛋白OATP1及MPR2的表達(dá)情況。

1.5 Western Blot檢測(cè)OATP、MRP2蛋白的表達(dá)

1.5.1 蛋白的提取及測(cè)定 將肝組織塊研磨搗碎后加入200 μl的RIPA裂解液(Solarbio，中國(guó))，在冰上吹打混勻，4 ℃放置10 min，4 ℃ 12 000×g，離心5 min，收集上清。將提取到的蛋白根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher，美國(guó))的使用說(shuō)明進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。分別取200 μl蛋白上清加200 μl純水混勻，加入80 μl的5×loading buffer，混勻，沸水煮5 min變性，冷卻至室溫，-20 ℃保存。

1.5.2 Western Blot取30 μl蛋白樣品進(jìn)行上樣，使用10%分離膠與5%濃縮膠配比的電泳膠于蛋白電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行電泳分離。然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國(guó))，5%脫脂牛奶中搖床封閉1 h，TBST洗膜2次后加入相應(yīng)一抗(OATP1、MRP2，Abcam，英國(guó))并于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后用TBST洗去一抗，然后加入相應(yīng)二抗,室溫?fù)u床2 h。最后于凝膠成像系統(tǒng)上成像記錄，然后用Image J圖像分析軟件測(cè)定各蛋白的灰度值，并將目的蛋白(OATP1、MRP2)灰度值與內(nèi)參GAPDH(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)灰度值的比值作為OATP1及MRP2的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：20150310002)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同信號(hào)區(qū)域首過(guò)快速上升期中的信號(hào)值、增強(qiáng)斜率百分比 B組行Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI掃描前后高(H)、中(M)、低(L)信號(hào)區(qū)域測(cè)得SIbase值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，進(jìn)一步兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tHM=6.88，PHM<0.001；tHL=11.84，PHL<0.001；tML=4.96，PML<0.001)； SIst值比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，進(jìn)一步兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tHM=5.46，PHM<0.001；tHL=10.49，PHL<0.001；tML=5.03，PML<0.001)；首過(guò)快速上升期中的增強(qiáng)斜率百分比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；增強(qiáng)斜率百分比之間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tHM=3.7，PHM<0.001；tHL=6.3，PHL<0.001；tML=2.7，PML<0.001)；A組行Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI掃描前后H、M、L信號(hào)區(qū)域測(cè)得SIbase值、SIst值、△t、強(qiáng)斜率百分比，兩組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(圖1，表1)。

表1 兩組首過(guò)快速上升期中的增強(qiáng)斜率百分比

2.2 OATP1和MRP2的表達(dá)水平 B組不同MRI信號(hào)區(qū)域的肝組織中，造影劑攝取蛋白OATP1及造影劑排泄蛋白MRP2的表達(dá)存在差異(P值均<0.05)。A組不同信號(hào)區(qū)之間OATP1的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組H、M、L信號(hào)區(qū)之間OATP1的表達(dá)呈逐漸下降的趨勢(shì)，M、L信號(hào)區(qū)OATP1的表達(dá)與A組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.301、3.641，P值均<0.05)。B組L信號(hào)區(qū)OATP1的表達(dá)與H、M信號(hào)區(qū)比較均有顯著下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tHL=3.436，PHL=0.002；tML=2.378,PML=0.024)。A組不同信號(hào)區(qū)之間MRP2的表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組H、M、L信號(hào)區(qū)MRP2的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢(shì)，H、M、L不同信號(hào)區(qū)MRP2的表達(dá)分別與A組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-7.236、-8.130、-9.614，P值均<0.05)。在B組H信號(hào)區(qū)MRP2的表達(dá)比M、L信號(hào)區(qū)均低，且其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tHM=-2.666，PHM=0.013；tHL=-3.897，PHL=0.001)(圖2，表2)。

表2 兩組OATP1、MRP2蛋白相對(duì)表達(dá)情況

2.3 OATP1、MRP2蛋白表達(dá)水平與信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)性

B組H、M、L信號(hào)區(qū)OATP1蛋白表達(dá)水平與增強(qiáng)后MRI信號(hào)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.692，P<0.05)，B組H、M、L信號(hào)區(qū)MRP2蛋白表達(dá)水平與增強(qiáng)后MRI信號(hào)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.514，P<0.05)(圖3)。

3 討論

ALF是由多種因素綜合導(dǎo)致肝損傷繼而引起肝性腦病、凝血障礙、黃疸、腹水等癥狀，使肝功能發(fā)生失代償或引發(fā)嚴(yán)重的器官功能衰竭。目前臨床上評(píng)估肝功能的方法如Child-Pugh分級(jí)、ICG血漿清除率及MELD評(píng)分系統(tǒng)等雖然能為肝病患者治療方案的制訂提供重要的參考價(jià)值[8]，但由于其相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)在檢測(cè)過(guò)程易受干擾，很難從客觀上準(zhǔn)確評(píng)價(jià)ALF時(shí)的肝功能及人工肝治療前后的肝功能。ALF發(fā)病后，肝組織損傷存在區(qū)域差異，因此，觀察治療前后不同損害嚴(yán)重程度肝細(xì)胞功能恢復(fù)情況，是臨床判斷治療效果的重要方法，隨著MRI影像學(xué)檢查的深入，新型造影劑如Gd-EOB-DTPA在肝臟疾病的應(yīng)用受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。

Gd-EOB-DTPA作為肝臟特異型造影劑在正常人體內(nèi)靜脈推注后分布在細(xì)胞外間隙，大約有50%由正常功能的肝細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜上表達(dá)的跨膜蛋白及OATP1攝取，然后經(jīng)由肝細(xì)胞毛細(xì)膽管細(xì)胞膜上的載體MRP2排泄入膽汁，剩余約50%通過(guò)腎臟途徑清除?，F(xiàn)有的研究[9]表明，在Gd-EOB-DTPA注射1.5 min后開(kāi)始被肝細(xì)胞攝取，約20%的給藥劑量在20 min時(shí)被轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞中。筆者前期研究[4]通過(guò)對(duì)犬類(lèi)ALF模型組和空白對(duì)照組均采用Gd-EOB-DTPA行MRI增強(qiáng)掃描，并測(cè)定平掃期、增強(qiáng)20 min不同時(shí)間感興趣區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)ALF組Beagle犬增強(qiáng)20 min時(shí)MRI顯示肝臟強(qiáng)化程度不一，呈高、中、低不均勻強(qiáng)化，以MRI增強(qiáng)20 min時(shí)信號(hào)值差異更明顯。因此，可采用Gd-EOB-DTPA注射后20 min時(shí)獲得的MRI圖像作為“標(biāo)準(zhǔn)”來(lái)評(píng)估大多數(shù)的肝損傷和肝功能[10]。此次研究進(jìn)一步測(cè)定時(shí)間-強(qiáng)度曲線(xiàn)的快速上升期，由此認(rèn)為Gd-EOB-DTPA造影劑從動(dòng)脈毛細(xì)血管進(jìn)入肝臟細(xì)胞間隙過(guò)程中以20 min作為最佳上升期，增強(qiáng)斜率反映的是對(duì)比劑濃度上升的速率，可隨著微循環(huán)血流量的增多，造影劑濃度上升的速率也會(huì)加快[10]。相反，若肝細(xì)胞功能受損，引起內(nèi)皮細(xì)胞受損及肝臟微循環(huán)障礙，對(duì)應(yīng)對(duì)比劑濃度上升速率減慢，因而肝衰竭組低信號(hào)區(qū)域首過(guò)灌注后信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到一定峰值后未再繼續(xù)升高。

肝細(xì)胞質(zhì)膜上不同區(qū)域的膜蛋白可通過(guò)各自不同轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制到達(dá)細(xì)胞的特定部位，行使不同功能。OATP1是屬于溶質(zhì)載體超家族的一種跨膜蛋白，它能介導(dǎo)多種有機(jī)化合物如Gd-EOB-DTPA通過(guò)肝臟基底膜，使其能夠快速被攝入肝細(xì)胞內(nèi)。據(jù)報(bào)道[11]，OATP1的表達(dá)在肝炎、肝硬化中表達(dá)下調(diào)。Ding等[12]及Katsube等[13]研究證實(shí)，正常肝細(xì)胞數(shù)量的減少及OATP1功能的減退會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞對(duì)Gd-EOB-DTPA攝取量減少，從而解釋肝纖維化時(shí)T1弛豫時(shí)間減少，信號(hào)降低。由此可知，肝臟相關(guān)疾病通過(guò)MRI增強(qiáng)掃描信號(hào)的高低程度與OATP1的表達(dá)相關(guān)。本研究將MRI定位下穿刺取得的肝組織采用Western Blot法檢測(cè)OATP1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALF組H、M、L不同信號(hào)區(qū)OATP1的表達(dá)與對(duì)照組相比呈逐漸下降的趨勢(shì)，并與肝細(xì)胞期信號(hào)減低的趨勢(shì)相一致。結(jié)合既往研究[4]HE染色結(jié)果提示MRI信號(hào)強(qiáng)度的高、低與肝組織HE染色下顯示的壞死程度呈負(fù)相關(guān)，即肝組織壞死越嚴(yán)重的區(qū)域MRI信號(hào)強(qiáng)度越低。由此可以說(shuō)明，Beagle發(fā)生ALF時(shí)，肝臟信號(hào)強(qiáng)度上升不明顯，OATP1的表達(dá)越低，對(duì)應(yīng)區(qū)域的MRI信號(hào)增強(qiáng)越不明顯，這與Ding等[12]及Katsube等[13]的研究結(jié)果相一致。

MRP2是屬于ABC超家族的一類(lèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要分布于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上，能夠促進(jìn)兩性陰離子化合物排泄進(jìn)入膽汁[14]。Saito等[15]研究發(fā)現(xiàn)MRP2蛋白的下降可導(dǎo)致Gd-EOB-DTPA的蓄積，從而引起MRI早期信號(hào)強(qiáng)度的增強(qiáng)。由此可以推測(cè)，當(dāng)MRP2表達(dá)升高時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)Gd-EOB-DTPA經(jīng)MRP2蛋白介導(dǎo)排泄入膽汁增加，Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)MRI的信號(hào)可能減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，ALF組MRP2的表達(dá)隨著肝損傷程度的增大而升高，且均比對(duì)照組高。曾經(jīng)有研究[16]報(bào)道，OATP在肝病中的表達(dá)是隨著時(shí)間的推移而變化的，急性毒性處理(對(duì)乙酰氨基酚和CCl4)可以誘導(dǎo)MRP2的表達(dá)，而長(zhǎng)期的CCl4誘導(dǎo)會(huì)降低MRP2的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相一致。ALF組肝內(nèi)H、M、L信號(hào)區(qū)MRP2的表達(dá)是逐漸升高的，而對(duì)應(yīng)區(qū)域的MRI信號(hào)強(qiáng)度是逐漸下降，推測(cè)是由于MRP2對(duì)Gd-EOB-DTPA排泄增多所致。

本研究也存在一些局限性。本研究雖然證實(shí)了OATP1及MRP2在ALF Beagle犬肝內(nèi)表達(dá)發(fā)生了改變，但并未深入研究引起這兩種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)改變的具體機(jī)制，這是將來(lái)需要深入探討的方向。

本研究結(jié)果表明，肝細(xì)胞期ALF Beagle犬增強(qiáng)MRI信號(hào)強(qiáng)度越低的區(qū)域，細(xì)胞膜表面OATP1的表達(dá)下降越明顯，肝細(xì)胞受損嚴(yán)重區(qū)域細(xì)胞內(nèi)無(wú)法攝取過(guò)多造影劑，信號(hào)強(qiáng)度上升的速率減慢。信號(hào)強(qiáng)度越低的地方MRP2的表達(dá)上升越明顯，對(duì)造影劑的排泄越快。這就說(shuō)明，急性肝細(xì)胞損傷時(shí)肝細(xì)胞期MRI信號(hào)的降低與OATP1及MRP2 的表達(dá)情況密切相關(guān)。筆者前期研究已經(jīng)證明ALF Beagle犬肝內(nèi)MRI信號(hào)的區(qū)域性差異與肝損傷程度相關(guān)。因此，認(rèn)為肝細(xì)胞膜表面OATP1及MRP2 的表達(dá)水平與肝實(shí)質(zhì)在Gd-EOB-DTPA增強(qiáng)肝細(xì)胞期的強(qiáng)化程度具有一定的關(guān)系，從而導(dǎo)致了肝內(nèi)MRI增強(qiáng)信號(hào)的差異，這為節(jié)段性評(píng)估肝細(xì)胞功能提供一定依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：黃建偉負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)及擬定寫(xiě)作思路；陳好負(fù)責(zé)論文撰寫(xiě)及數(shù)據(jù)收集、分析；王昊負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集，分析及指導(dǎo)撰寫(xiě)文章；歐陽(yáng)中敏、劉志強(qiáng)負(fù)責(zé)影像學(xué)數(shù)據(jù)收集及資料分析。