血清外泌體來源的microRNA-221-3p在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

吳俊藝， 賴智德， 田毅峰， 王耀東

1 福建省立醫(yī)院 肝膽胰外科， 福州 350001; 2 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院 肝膽胰外科， 南京 210008

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，HCC的發(fā)展具有多種癌癥特征，如持續(xù)性細(xì)胞增殖、逃避凋亡、誘導(dǎo)血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等[1]。目前較為公認(rèn)的有效HCC治療方式主要是手術(shù)切除及肝移植，但是HCC發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，絕大多數(shù)腫瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即是晚期，從而失去手術(shù)時(shí)機(jī)[2]。因此，深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制、尋找新的HCC早期診斷標(biāo)志物具有重要意義。目前臨床上AFP的檢測是HCC篩查的主要手段，但是其對(duì)HCC的敏感性較低，所以尋找其他對(duì)HCC具有特異性的腫瘤標(biāo)志物尤為重要[3]。最近，多項(xiàng)研究[4-5]結(jié)果表明，血清外泌體中異常表達(dá)的microRNA(miRNA)與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后緊密相關(guān)，可能成為一種新型的腫瘤診斷分子標(biāo)志物。然而，關(guān)于血清外泌體來源的miRNAs在HCC診斷及預(yù)后中的研究相對(duì)較少。本研究分析血清外泌體來源miRNA-221-3p的表達(dá)水平與HCC患者的臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性，旨在探討血清外泌體來源miRNA-221-3p作為新型分子標(biāo)志物在HCC早期診斷及預(yù)后判斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年2月-2014年12月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療后組織病理診斷為HCC的66例患者進(jìn)行回顧性研究，選取25例同期在本院接受健康檢查的體檢者作為對(duì)照組。隨訪截止時(shí)間 2019年2月，HCC患者的生存時(shí)間為從手術(shù)開始到因任何原因死亡或最后1次隨訪的時(shí)間。診斷及臨床分期參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范( 2017年版)》[6]。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次手術(shù)切除患者，術(shù)后病理診斷為HCC; (2) 無其他心肺腎等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn): (1)臨床資料不完整及失訪者; (2) 合并心、肺、腎等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者; (3) 非原發(fā)病灶者; (4) 妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 主要試劑 外泌體提取試劑盒ExoQuickTM Kit購買自美國System Biosciences公司，CD63抗體、Alix抗體和HSP70抗體購買自美國Abcam公司，Trizol RNA 提取試劑購買自美國 Life Technologies 公司，RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green Real-time PCR 試劑盒購買自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌體的提取 分別取HCC組及對(duì)照組血清，根據(jù)ExoQuickTM Kit說明書提取血清外泌體，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要用PBS緩沖液、蛋白質(zhì)裂解液及RNA裂解液重懸沉淀。

1.3.2 透射電子顯微鏡檢測血清外泌體 血清外泌體(10 μg)滴于專用銅網(wǎng)上(購自北京中興科依科技有限公司)，1%戊二醛固定液固定10 min，PBS緩沖液漂洗，室溫靜置待揮干，2%磷鎢酸負(fù)染后采用透射電子顯微鏡(JEM-2100)在100 kV電壓下進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.3 蛋白免疫印跡 通過含有蛋白酶抑制劑的裂解液重懸血清外泌體后提取總蛋白進(jìn)行分析。將提取后的蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，以5%脫脂牛奶封閉1 h后，anti-HSP70及anti-CD63一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS緩沖液沖洗后二抗孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照(Tanon 5200成像系統(tǒng))。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR miRNA-221-3p引物，上游：5′-AGACCTGATACTGAGTGAAG-3′，下游：5′-GACGTCGAGATCGCATAG-3′；U6 引物，上游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′，下游：3′-CAGCATAGGTCACGTCCCAGGCTCCATAAGCGTGACCTATGCTCTTTTAT-5′，由廣州銳博公司設(shè)計(jì)與合成。用RNA提取試劑(Trizol)重懸血清外泌體后，按照常規(guī)Trizol法提取血清外泌體的總RNA，測定提取總RNA濃度，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保持。逆轉(zhuǎn)錄后按照SYBR Green Real-time PCR試劑盒說明書操作，條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性34 s，重復(fù)2、3步驟40個(gè)循環(huán)，血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達(dá)水平采用2-ΔΔCt計(jì)算。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20180120)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用 Kaplan-Meier方法及 log-rank 檢驗(yàn)分析HCC患者的預(yù)后，采用 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體的形態(tài)特征 血清外泌體可表達(dá)HSP70、CD63和Alix(圖1a)，外泌體外觀為圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為40～100 nm(圖1b)。

2.2 HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p的表達(dá)水平HCC組血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=354.00，P<0.001)(圖2)。

2.3 HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p的表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p的表達(dá)水平升高3倍設(shè)定為cut-off值，將其分為高表達(dá)組(n=40)和低表達(dá)組(n=26)。HCC患者血清外泌體中miR-221-3p高表達(dá)組與低表達(dá)組的腫瘤大小(χ2=6.016，P=0.014)、包膜侵犯(χ2=7.580，P=0.006)和TNM分期(χ2=6.340，P=0.012)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在性別、年齡、乙型肝炎、分化程度、AFP以及肝硬化等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。Kaplan-Meier生存曲線的結(jié)果顯示，高表達(dá)組的總生存期明顯短于低表達(dá)組(χ2=17.105，P<0.001)(圖3)。

表1 HCC患者血清外泌體miRNA-221-3p的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 HCC患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 采用 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析HCC患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素，單因素分析結(jié)果顯示:腫瘤大小、包膜侵犯、TNM分期及血清外泌體中miRNA-221-3p的表達(dá)水平是HCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)。多因素Cox分析結(jié)果顯示：血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達(dá)水平[風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=2.434，95%可信區(qū)間(95%CI): 1.178～5.027，P=0.016]及TNM分期(HR=2.653，95%CI: 1.222～5.760，P=0.014)是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

表2 影響HCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

外泌體是一種直徑40～100 nm的膜性囊泡，廣泛分布在人體體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等[7]。外泌體含有多種生物活性的成分，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和miRNA等，參與細(xì)胞間通訊、免疫應(yīng)答、蛋白及核酸運(yùn)輸?shù)壬磉^程[7]。越來越多的研究[8-9]表明，內(nèi)含于外泌體中的多種miRNAs在惡性腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展中具有重要作用，可以作為腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷的新型分子標(biāo)志物。外泌體中miRNA可簡便地從血清中收集，并且其分析相對(duì)簡單。檢測外泌體中miRNA的表達(dá)水平是無創(chuàng)性的，因此外泌體中miRNA具有成為早期癌癥篩查生物標(biāo)志物的潛力。

以往研究[10-11]發(fā)現(xiàn)HCC患者血清外泌體中miRNA-21的表達(dá)水平升高且與預(yù)后相關(guān)，而血清中miRNA-21表達(dá)水平相對(duì)較低，說明血清外泌體中miRNA異常表達(dá)對(duì)HCC的早期診斷及預(yù)后判斷更具潛在價(jià)值。另一種血清外泌體來源的miRNA-125b可以作為預(yù)測HCC預(yù)后的指標(biāo)[12]。另有Qu等[13]研究發(fā)現(xiàn)外泌體來源的miRNA-665與HCC患者包膜浸潤、腫瘤大小、臨床分期及總生存期等密切相關(guān)。張?jiān)频萚14]研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體來源的miRNA-122對(duì)HCC的診斷效能明顯高于AFP，可作為一種新型的用于HCC早期臨床診斷的分子標(biāo)志物。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA-718與肝移植術(shù)后HCC患者的預(yù)后相關(guān)，并且最近研究[16-17]發(fā)現(xiàn)血清外泌體中miRNA-224和miRNA-638可以促進(jìn)HCC的進(jìn)展，與HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。但是目前血清外泌體中miRNA在HCC的早期臨床診斷及其發(fā)生發(fā)展中的作用和具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本課題組通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，血清外泌體含有HSP70、Alix及CD63標(biāo)志性蛋白，通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)血清外泌體外觀為圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為40～100 nm，符合外泌體形態(tài)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HCC組及對(duì)照組中血清外泌體來源的miRNA-221-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在HCC患者中，血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組，并且miRNA-221-3p高表達(dá)與HCC患者腫瘤大小、包膜侵犯及臨床分期等密切相關(guān)，提示其表達(dá)水平與HCC患者較差的臨床病理特征有關(guān)。在此研究基礎(chǔ)上，采用Kaplan-Meier生存曲線分析血清外泌體來源miRNA-221-3p的表達(dá)水平與總生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示，miRNA-221-3p高表達(dá)組的總生存期明顯短于低表達(dá)組，預(yù)后不佳。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中miRNA-221-3p的表達(dá)水平及腫瘤分期是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說明血清外泌體miRNA-221-3p的表達(dá)水平具有判斷HCC預(yù)后的潛在價(jià)值。綜上所述，HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p 表達(dá)水平明顯上調(diào)，且與臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)，可能作為HCC患者新型臨床預(yù)后的判斷指標(biāo)。但血清外泌體中miRNA-221-3p在HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。隨著外泌體提取技術(shù)的發(fā)展及其在分子機(jī)制的深入研究，相信外泌體來源miRNA作為惡性腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷的參考指標(biāo)具有廣闊的前景。