正交法優(yōu)化黃精地上莖葉中有效成分的提取工藝

楊澤娃 譚華影子 陳巧云 胡雪琪 武蕓 陳治宇

摘要：以黃精（ Polygonatum sibiricum）地上部莖葉為試材，采用單因素試驗研究了料液比、提取溫度、提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取黃酮、多酚和多糖得率的影響。通過正交試驗優(yōu)化黃酮、多酚和多糖的提取工藝。結(jié)果表明，提取黃酮最佳條件為提取溫度70℃，料液比1：80，提取時間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，黃酮平均得率為4.01%;提取多酚最佳條件為料液比1：40，提取溫度80℃，提取時間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，多酚平均得率為0.62%;提取多糖的最佳條件為提取溫度80℃，料液比1：20，提取時間2.0h，多糖平均得率為18.61%。驗證試驗表明，這3種優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：黃精（Polygonatum sibiricum）;黃酮;多糖;多酚;優(yōu)化;提取工藝;正交試驗

中圖分類號：R282

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 12-0139-06

D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.12.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科（Liliace-ae）黃精屬（Polygonatum）草本植物，根莖橫走，圓柱狀，結(jié)節(jié)膨大，葉輪生，無柄，目前已知的黃精藥材種類有3種，包括滇黃精、黃精和多花黃精[1]。黃精是藥食同源植物之一，其味甘、性平，具有潤肺、補(bǔ)氣、益腎補(bǔ)精，延年益壽、降血糖血壓等作用，長期服用可以改善人的體質(zhì)[2]。一般黃精加工和利用的部位是地下的塊莖，對于地上部分的莖、葉開發(fā)利用的較少。通過預(yù)試驗得知，其地上莖葉也含有黃酮、多酚和多糖等活性成分，因此為了充分利用黃精原材料，使地上莖葉變廢為寶，本試驗通過正交法優(yōu)化黃精地上莖葉中有效成分的提取工藝，從而提高黃精的綜合開發(fā)利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

黃精采自湖北省恩施州恩施市大地生物研究所黃精科研基地，試驗所用材料為黃精的地上部分（莖、葉）。

1.1.1 試劑與儀器 主要試劑：蘆丁、苯酚、石油醚、濃硫酸、硝酸鋁、碳酸鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、去離子水、氫氧化鈉、沒食子酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、Foline-phenol試劑。所有試劑為分析純，蒸餾水為雙蒸水。

主要儀器：DZF-6090真空干燥箱、DFY-500搖擺式高速萬能粉碎機(jī)、HWS12電熱恒溫水浴鍋、TDL-80-2B低速臺式離心機(jī)、冷凍離心機(jī)、TU-1810紫外可見分光光度計、FA-1004B電子分析天平。

1.1.2材料的預(yù)處理將新鮮黃精的地上部分（莖和葉）分別用自來水洗凈，再用雙蒸水沖洗2-3次，晾干后切碎，于60℃烘箱中烘至恒重，用粉碎機(jī)磨成粉末，過60目篩，將制成的粉末用石油醚按照料液比1：2（g/mL）進(jìn)行脫脂，浸泡ld后回收石油醚，接著將粉末重新置于60℃烘箱中烘至恒重，裝于試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，置于干燥器內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝流程藥材脫脂一熱水浸提一離心一收集上清液一濃縮一活性炭除色素一醇沉一離心，取部分上清液減壓濃縮后冷凍干燥，得到黃酮粗提物（提取多酚工藝流程同上），取沉淀物溶于水中，即得到黃精多糖的粗提物。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及含量測定采用亞硝酸鈉一硝酸鋁一氫氧化鈉絡(luò)合分光光度法測定黃酮的含量[3|。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)（x），蘆丁溶液吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程y=8.687 5x-0.057 I（R2=O.ggg 7）。采用Folin-Ciocalteu法測定多酚的含量[4]。以沒食子酸的體積分?jǐn)?shù)作為橫坐標(biāo)（x），沒食子酸的吸光度作為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=104.7x+0.000 5（R2=0.999 3）。采用苯酚一硫酸法測定多糖的含量[5]。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=10.506x+0.001 6（R2=0.999 5）。

含量計算公式：得率=（Nx VxClm） x100%，式中，Ⅳ為稀釋倍數(shù)，y為樣品溶液的最終稀釋體積（mL），C為樣品溶液中有效成分的質(zhì)量濃度（ mg/mL），m為藥材質(zhì)量（mg）。

1.2.3 單因素試驗

1）料液比。

黃酮：精確稱取待測樣品1.0 g，設(shè)置料液比為1：20、1：40、1：60、1：80、1：100，每組重復(fù)3次，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度80℃、提取時間1.0 h，提取2次，得到最佳料液比。

多酚：設(shè)置料液比為1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70，每組重復(fù)3次，固定提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，方法同上。

多糖：設(shè)置料液比為1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40，無水乙醇溶液，其余條件同上。

2）提取溫度。

黃酮：精確稱取待測樣品1.0 9，設(shè)置溫度為40、50、60、70、80、90、100℃，每組重復(fù)3次，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1：80，提取時間1.0 h，試驗提取2次，得到最佳提取溫度。

多酚：設(shè)置溫度為30、40、50、60、70、80、90、100℃，固定料液比1：50，方法同上。

多糖：設(shè)置溫度為40、50、60、70、80、90℃，固定料液比1：20，無水乙醇溶液，其余條件同上。

3）提取時間。

黃酮：精確稱取待測樣品1.0 9，設(shè)置提取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，每組重復(fù)3次，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1：80，提取溫度80℃，試驗提取2次，得到最佳提取時間。

多酚：設(shè)置提取時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，固定料液比1：50，提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，方法同上。

多糖：設(shè)置提取時間為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，料液比1：20，無水乙醇溶液，其余條件同上。

4）乙醇體積分?jǐn)?shù)。

黃酮：精確稱取待測樣品1.0 9，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、l00%，每組重復(fù)3次，固定料液比1：80，提取時間1.0 h，溫度80℃，試驗提取2次，得到最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

多酚：乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，固定料液比1：50，提取時間1.0 h，溫度70℃，方法同上。

1.2.4正交試驗設(shè)計正交試驗設(shè)計因素與水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1料液比對黃精有效成分得率的影響 由圖1可知，料液比從1：20到1：100時，黃精莖葉中黃酮得率呈逐漸增長趨勢;當(dāng)料液比達(dá)到1：80后，黃酮得率趨于平穩(wěn)。原因可能是當(dāng)料液比在1：80時，黃精中黃酮得到最大程度的溶解。試驗結(jié)果表明（圖2），料液比為1：20-1： 50時，黃精多酚得率呈增長趨勢;當(dāng)料液比超過1：50后，多酚得率逐漸平穩(wěn)。原因可能是當(dāng)料液比在1：50時，黃精多酚已經(jīng)達(dá)到最大程度的溶解。由圖3可知，料液比為1：10-1：20時，黃精莖葉中多糖得率呈上升趨勢;當(dāng)料液比超過1：20后，多糖得率增長變得穩(wěn)定，原因可能是隨著料液比的上升，樣品中的多糖已經(jīng)全部溶解在提取液中。

2.1.2提取溫度對黃精有效成分得率的影響 由圖4可知，溫度在40-70℃，隨著溫度的升高，黃精莖葉中黃酮得率呈上升趨勢;在溫度到達(dá)70℃后，其得率呈下降趨勢。原因可能是溫度較低時黃酮不能充分溶出，溫度過高會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。試驗結(jié)果（圖5）顯示，溫度在30-70℃，隨著溫度的升高，多酚得率呈上升趨勢;在溫度達(dá)到70℃后，其得率基本呈下降趨勢。原因可能是溫度較低時多酚不能充分溶出，溫度過高會破壞多酚的結(jié)構(gòu)。由圖6可知，溫度在40-80℃，隨著溫度升高，多糖得率呈上升趨勢;溫度超過80℃時，其得率呈下降趨勢，原因可能是高溫條件下多糖結(jié)構(gòu)被破壞。

2.1.3提取時間對黃精有效成分得率的影響 由圖7可知，提取時間在0.5-1.5 h，隨著時間推移，黃精莖葉中黃酮得率呈上升趨勢;提取時間在1.5-2.5 h，其得率呈下降趨勢。原因可能是提取時間過長，導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被破壞。由圖8可知，在提取時間在0.5-1.5 h，隨著時間推移，多酚得率逐漸升高，提取時間在1.5-3.0 h，其得率呈下降趨勢。原因可能是提取一定時間后，多酚已被最大限度地提取完成，時間再延長，只能增加多酚的氧化和破壞。由圖9可知，提取時間在1.0-2.0 h，隨著時間的推移，多糖得率呈上升趨勢;提取時間在2.0-4.0 h，其得率呈下降趨勢;提取時間在4.0-5.0 h，其得率趨于平穩(wěn)。原因可能是樣品中水溶性多糖大約在2.0 h處已完全溶解，隨后出現(xiàn)下降趨勢，可能是提取時間過長，導(dǎo)致部分水溶性多糖的糖鏈斷裂，最終趨于平穩(wěn)。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃精有效成分得率的影響由圖10可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40% -90%時，黃酮得率呈持續(xù)上升趨勢;乙醇體積分?jǐn)?shù)超過90%后，其得率明顯下降。由圖11可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30% -50%時，多酚得率呈持續(xù)上升趨勢;乙醇體積分?jǐn)?shù)超過50%后，其得率呈下降趨勢。

2.2 正交試驗結(jié)果分析

2.2.1 正交試驗結(jié)果表2、表3和表4分別為黃精地上部分的黃酮、多酚和多糖提取的正交試驗結(jié)果。在正交試驗中，黃精地上部黃酮最高得率為3.91%，此時提取條件為A3B2C4D3，即料液比1：80，提取溫度70℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%。黃精多酚最高得率為0.57%，此時提取條件為A283CID3，即料液比1：40，提取溫度80℃，提取時間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。黃精多糖最高得率為18.55%，此時提取條件為A2B2C2，即料液比1：20，提取時間2.0 h，提取溫度80℃。

2.2.2 方差分析從表5可知，料液比對黃酮和多糖得率影響不顯著，但對多酚得率有顯著影響;提取溫度對黃酮得率的影響不顯著，但對多糖得率和多酚得率有極顯著和顯著影響;提取時間對黃酮和多酚得率影響不顯著，但對多糖的得率有顯著影響;乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮和多酚得率有顯著影響;4個因素對黃精黃酮得率的影響大小順序為D>C>B>A，對黃精多酚得率的影響順序為A>B>D>C，對多糖得率的影響順序從高到低為B>C>A。

2.2.3 驗證試驗分別稱取黃精樣品粉末1.0 g，在對應(yīng)工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，提取黃酮的條件為料液比1：80，提取溫度70℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%;提取多酚的條件為料液比1：40，提取溫度80℃，提取時間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%;提取多糖的條件為料液比1：20，在80℃水浴鍋中水浴2.0 h，平行試驗3次。黃精黃酮得率為4.01%，多酚平均得率為0.62%，大于正交試驗結(jié)果，多糖平均得率為18.61%，與正交試驗中的最大得率相近，即該最佳提取工藝穩(wěn)定可行。

3 小結(jié)與討論

經(jīng)過正交試驗優(yōu)化了黃精莖葉中黃酮的提取工藝，得到最佳提取工藝條件為料液比1：80，提取溫度70℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，該條件下黃酮得率為4.01%。試驗最終結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用黃精莖葉中的黃酮提供了可行的方法。李鶯等[6]認(rèn)為黃酮類化合物可能是黃精發(fā)揮多種藥理作用的活性因子。本試驗中黃精莖葉中黃酮的含量相對較高，可以加大對黃精莖葉中黃酮的開發(fā)力度。通過正交試驗優(yōu)化了黃精莖葉中多酚的提取工藝，得到最佳提取工藝條件為料液比1：40，提取溫度80℃，提取時間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，該條件下多酚得率為0.62%。李濤等[7]對蘋果渣多酚的提取分離技術(shù)進(jìn)行了研究，得出在最佳提取工藝下得率為0.121%。李椒等[8]對菠蘿皮渣多酚提取工藝進(jìn)行了研究，得出在最佳提取工藝下得率為0.777%。魏璐[9]對玉米花絲多酚提取技術(shù)進(jìn)行了研究，得出在微波最佳提取工藝下得率為0.599%。巫永華等[10]對黃精塊莖中多酚提取工藝進(jìn)行了研究，得出在最佳提取工藝下得率為0.478 8%。因此，對比黃精塊莖和其他植物中的多酚含量，黃精地上部多酚含量處于較高水平。通過正交試驗優(yōu)化了黃精莖葉中多糖的提取工藝，獲得最佳提取工藝條件為料液比1：20，提取溫度80℃，提取時間2.0 h，該條件下多糖得率為18.61%。

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[10]巫永華，劉恩岐，張建萍，等，黃精多酚的閃式提取及抗氧化活性研究[J].食品科技，2017，42（8）：231-236.

基金項目：恩施州科技研究與開發(fā)項目（ XYJ2018000013）;湖北民族大學(xué)2019年大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目;湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（ D20141903）

作者簡介：楊澤娃（1998-），女，湖北荊州人，在讀本科生，研究方向為生物科學(xué)，（電話）15172873623（電子信箱）526481778@qq.com;通信作者，武蕓（1971-），女，副教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，（電話）18872785678（電子信箱）13560177516@qq.com。