嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在纖維素乙醇生產(chǎn)中的研究進展

劉登 劉均洪

（1. 山東理工職業(yè)學(xué)院化工學(xué)院，濟寧 272067；2. 青島科技大學(xué)化工學(xué)院，青島 266042）

隨著全球工業(yè)化進程的推進，能源需求越來越大，而傳統(tǒng)化石燃料的儲備卻日漸枯竭，加上全球范圍內(nèi)溫室效應(yīng)的加劇和環(huán)保壓力的增加，各國正不斷尋求化石燃料的替代能源。生物乙醇因其原料廣泛性、可再生性、環(huán)境友好性以及技術(shù)可行性逐漸受到各國科研人員的重視，被認為是傳統(tǒng)液體燃料最有潛力的替代產(chǎn)品［1］。目前，生物乙醇已經(jīng)在全球?qū)崿F(xiàn)了商業(yè)化，尤其是美國和巴西，不過，商業(yè)化的生物乙醇現(xiàn)階段主要是以可食用的淀粉基原料為底物，這在一定程度上造成了糧食危機，當非洲等貧困地區(qū)還存在大量饑餓人口時，淀粉基生物乙醇的生產(chǎn)和應(yīng)用便受到各國政府的限制。而纖維素乙醇是以不可食用的木質(zhì)纖維素為原料，其全球儲量巨大，價格便宜且可再生，不會造成任何社會和經(jīng)濟問題，這使得纖維素乙醇未來的商業(yè)前景極其廣闊。

然而，目前纖維素乙醇過高的生產(chǎn)成本在很大程度上限制了它的商業(yè)化進程。從纖維素乙醇生產(chǎn)的工藝經(jīng)濟可行性分析發(fā)現(xiàn)，造成其生產(chǎn)成本過高的原因，主要是在木質(zhì)纖維素原料的生物乙醇轉(zhuǎn)化過程中存在許多技術(shù)瓶頸，這些技術(shù)瓶頸不僅造成了大量的能源或試劑消耗，還導(dǎo)致部分原料的浪費和乙醇收率的嚴重下降［2］。為了解決這些問題，經(jīng)濟有效的生物催化劑（木質(zhì)纖維素酶）的選擇和利用被認為是纖維素乙醇未來的關(guān)鍵?？墒抢w維素乙醇規(guī)模化生產(chǎn)中的極端條件又極大限制了常規(guī)嗜溫酶的活性和穩(wěn)定性。針對這種狀況，嗜熱性木質(zhì)纖維素酶因其高催化活性、熱穩(wěn)定性和對化學(xué)變性劑的抵抗力等獨特優(yōu)勢引起了科研人員的極大關(guān)注［3］。本文將從如何提高嗜熱酶產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性方面介紹嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在纖維素乙醇生產(chǎn)應(yīng)用中的研究進展。

1 纖維素乙醇生產(chǎn)中存在的技術(shù)瓶頸

木質(zhì)纖維素是地球上儲量豐富且可再生的生物質(zhì)原料，作為纖維素乙醇的原始底物潛力巨大［4］。從木質(zhì)纖維素原料到生物乙醇的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)路線早已證實是可行的，纖維素生物乙醇也被認為具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景。然而，至今為止纖維素乙醇的市場占有率卻非常低，Elsayed等［5］通過對纖維素乙醇生產(chǎn)流程的經(jīng)濟性分析發(fā)現(xiàn)，過高的預(yù)處理運營成本是影響其經(jīng)濟可行性的關(guān)鍵因素。研究表明，纖維素乙醇生產(chǎn)的工藝路線雖然已經(jīng)打通，但生物轉(zhuǎn)化過程中卻依然存在著許多技術(shù)瓶頸，這些技術(shù)瓶頸一方面制約著生物乙醇的底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品收率；另一方面也導(dǎo)致了它的生產(chǎn)成本一直居高不下［6］。

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)從結(jié)構(gòu)上來看，主要是由纖維素（35%-50%），半纖維素（30%-35%）和木質(zhì)素（10%-40%）組成［7］。其中，纖維素是由D-葡萄糖單元通過是由β（1→4）糖苷鍵組成的高分子線性均聚物，可以通過3種酶（內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶）實現(xiàn)它的完全解聚，是目前產(chǎn)纖維素乙醇微生物的主要發(fā)酵底物；半纖維素是由不同類型的五碳糖和六碳糖構(gòu)成的復(fù)雜異質(zhì)高聚物，它的解聚需要多種酶（如木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿魏酸酯酶和甘露聚糖酶等）的聯(lián)合作用，主要水解產(chǎn)物為以木糖為主的五碳糖，在現(xiàn)階段纖維素乙醇的生產(chǎn)中利用率較低；木質(zhì)素則是由3種主要單體（對香豆醇、松柏醇和芥子醇）形成的復(fù)雜酚類聚合物，其水解通常也涉及3種主要的酶（木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶），其水解產(chǎn)物無法被產(chǎn)醇微生物利用。在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中，纖維素多糖鏈之間通過氫鍵彼此連接形成結(jié)晶纖維素，半纖維素和其他多糖特別是果膠再與結(jié)晶纖維素形成膠結(jié)層，該結(jié)構(gòu)最終再被木質(zhì)素包圍形成微纖維，許多這樣的微纖維一起構(gòu)成木質(zhì)纖維素［8］。

木質(zhì)纖維素具有上述致密的剛性結(jié)構(gòu)，其在作為纖維素乙醇的原料使用時必須進行適當?shù)仡A(yù)處理，通過破壞半纖維素和木質(zhì)素形成的物理屏障以提高結(jié)晶纖維素的表面可及性。在纖維素乙醇的生產(chǎn)過程中（原料收集、預(yù)處理、水解糖化、發(fā)酵和蒸餾），原料的預(yù)處理目前尚存在許多技術(shù)瓶頸。通常的預(yù)處理方法包括物理法、化學(xué)法和生物法，這些技術(shù)方法主要涉及到酸、堿、氨纖維爆炸、離子液體處理、有機溶劑、臭氧分解、蒸汽處理、濕式氧化、微波輻射和酶等。然而，高昂的運營成本、大量溶劑的使用、抑制劑的形成、生物活性的損失、戊糖的浪費、產(chǎn)物抑制以及乙醇收率的降低，都限制著纖維素乙醇的商業(yè)化部署［9］，盡管發(fā)現(xiàn)酶法降解木質(zhì)纖維素是比物理法和化學(xué)法更有效的方法，但中溫酶對工業(yè)條件的不適應(yīng)性和高成本限制了它的應(yīng)用［10］，這迫使科研人員不得不繼續(xù)尋求更加經(jīng)濟高效的預(yù)處理方法。于是，近幾年嗜熱酶便逐漸引起了各國研究人員的關(guān)注。本文將根據(jù)最新文獻研究對嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的特點和研究進展進行重點介紹。

2 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的特點

生物法預(yù)處理木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的過程中，涉及到一整套復(fù)雜的木質(zhì)纖維素酶，它包括纖維素酶系、半纖維素酶系和木質(zhì)素酶系，每組酶系又是由許多具有不同功能和底物特異性的酶構(gòu)成，如內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶，阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、錳過氧化物酶和漆酶等。木質(zhì)纖維素便是在這些酶的共同作用下將纖維素釋放出來并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖和其他降解產(chǎn)物的。然而，由于工業(yè)生產(chǎn)中的高溫和極端pH等苛刻條件，使得常規(guī)嗜溫性酶系的活性和穩(wěn)定性都受到限制［11］，為了改善這種狀況，科研人員對嗜熱性酶的研究逐漸增多。

嗜熱性酶來自于嗜熱微生物，能耐受80-120℃的高溫和廣泛的pH（0.5-11）值，這種特性允許生產(chǎn)過程可以維持在相對較高的溫度下進行。在較高的溫度下，底物溶解度增大、反應(yīng)速率提高、雜菌污染幾率下降、揮發(fā)性物質(zhì)的快速揮發(fā)減少了對發(fā)酵微生物的產(chǎn)物抑制、乙醇收率增加、避免了中間過程的冷卻處理、節(jié)約了成本、縮短了反應(yīng)時間［12］。另外，嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在高溫下能夠保持良好的催化性能和穩(wěn)定性、具有一定程度的抑制劑耐受性?；谶@些優(yōu)點，研究人員相信嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的應(yīng)用有助于纖維素乙醇生產(chǎn)的工藝經(jīng)濟性［13］。

然而，受限于嗜熱性微生物苛刻的生存條件和培養(yǎng)規(guī)模，目前嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的產(chǎn)量無法滿足纖維素乙醇生產(chǎn)的工業(yè)化需求，加上工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)境與其最適工作條件具有偏差，嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的活性和穩(wěn)定性也受到影響［14］。所以，對于科研工作者來說，選擇合適的方法提高嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的產(chǎn)量、增大酶的活性和穩(wěn)定性、降低它的生產(chǎn)成本便是下一步的研究重點。

3 纖維素乙醇生產(chǎn)中嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的研究進展

利用嗜熱性木質(zhì)纖維素酶生產(chǎn)纖維素乙醇，既能克服嗜溫酶在工業(yè)化生產(chǎn)中存在的各種缺陷，又能增大底物溶解率、加快反應(yīng)速率、降低雜菌污染風(fēng)險、節(jié)約系統(tǒng)冷卻成本以及提高產(chǎn)品收率，因此展現(xiàn)出了巨大的商業(yè)應(yīng)用潛力［15］。然而，受限于它的高成本，如何提高嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性以加速其商業(yè)化部署便成為了科研人員的主要研究方向。圖1展示了目前嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在纖維素乙醇生產(chǎn)應(yīng)用中的主要研究熱點。

3.1 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的篩選

圖1 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶主要研究熱點

嗜熱性酶來源于嗜熱性微生物，為了獲得優(yōu)良的嗜熱性微生物菌株，研究人員采用了多種篩選策略。常規(guī)做法就是從各種不同的極端環(huán)境進行微生物的分離和鑒定，Saurabh等［16］從印度Leh和Ladakh地區(qū)的溫泉水中分離出11種能夠降解纖維素的細菌菌株，其中Bacillus subtilisBHUJPV-H19 在最適溫度50℃時的β-葡萄糖苷酶活性為5.65 U/mL；Aikawa等［17］從牛糞堆肥中分離出一株富含糖苷家族GH11、GH2以及木聚糖酶的菌株Herbivorax saccincolaA7，它在pH 9和55℃時表現(xiàn)出較高的木質(zhì)纖維素分解活性；Tan等［18］從牛糞便中篩選出一株Chryseobacterium屬的嗜熱性菌株，該菌株能產(chǎn)生具有纖維素酶-木聚糖酶雙功能活性的嗜熱性酶，在pH 9和90℃下對羧甲基纖維素的內(nèi)切葡聚糖酶活性為3 237 U/mg，在pH 8和90℃下對樺木木聚糖的木聚糖酶活性為1 793 U/mg，將該酶作用于由稻草組成的蘑菇培養(yǎng)底物時，與某商業(yè)纖維素酶和木糖酶相比，葡萄糖產(chǎn)量是后者的9.2-15.7倍，木糖產(chǎn)量是后者的3.5-4.3倍；Shahi等［19］從黃石國家公園的酸性溫泉中分離出一株Acidothermus cellulolyticus11B，該菌株能產(chǎn)生一種具有木聚糖內(nèi)切酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶活性的三功能酶，該酶在70℃和pH 6.0時表現(xiàn)出很高的活性。上述研究表明，通過傳統(tǒng)的篩選方法可以從極端環(huán)境中獲取到具有優(yōu)良性能的嗜熱性木質(zhì)纖維素酶，但是這種方法篩選過程比較繁瑣且篩選通量較低，為了提高篩選效率，研究人員開發(fā)出了一種高通量的篩選方法即宏基因組篩選。Ariaeenejad等［20］根據(jù)駱駝瘤胃宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)，使用五階段計算篩選程序從駱駝瘤胃大量微生物菌群酶中快速找到了具有很寬pH值（6-11）和溫度（30-90℃）范圍的木聚糖酶。有研究人員表示，篩選性能優(yōu)良的嗜熱性微生物菌株是獲得具有高產(chǎn)量、高活性和熱穩(wěn)定性嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的前提。所以，在大自然這種獨特而多樣性的進化環(huán)境中，堅持傳統(tǒng)的野生菌株篩選始終是一種不可或缺的手段。同時，開發(fā)和應(yīng)用宏基因組學(xué)和現(xiàn)代測序技術(shù)等高通量篩選策略，探索嗜熱性微生物群落多樣性的微生物環(huán)境，快速預(yù)測和鑒定樣品中所有微生物及其酶的種類，將極大提高篩選效率，有助于在較短時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)一批全新的嗜熱性木質(zhì)纖維素酶，從而強化其在纖維素乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用［21］。

3.2 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的修飾

在纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)中，極端的環(huán)境條件使工作用酶活性和穩(wěn)定性都大幅度下降，這在一定程度上增加了纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。研究人員發(fā)現(xiàn)，通過對酶的遺傳或化學(xué)修飾可以提高其催化活性或改善因pH、熱或抑制劑等引起的穩(wěn)定性和壽命的下降，從而可以間接降低用酶成本。Brogan等［22］通過表面陽離子化反應(yīng)對嗜熱性葡糖苷酶進行化學(xué)修飾，然后將陽離子化葡糖苷酶與表面活性劑乙醇酸聚乙氧基月桂醚結(jié)合制備了一種酶-聚合物表面活性劑納米結(jié)構(gòu)，經(jīng)修飾的葡糖苷酶可以將熱穩(wěn)定性提高到137℃，對纖維素的酶活提高了30倍。Darby等［23］將結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的小分子激活劑整合到一個特定位點以共價修飾Bacteroides thetaiotaomicron的糖苷水解酶BtGH84，結(jié)果表明，修飾后的酶催化活性提高了35倍，同時還增強了對某些抑制劑的耐受性。Boonyapakron等［24］在嗜熱性木聚糖酶Xyn12.2的β-折疊核心的N末端和α-螺旋之間引入了兩個二硫鍵，修飾后的酶在pH 9.0、50℃時催化效率增加了4.2倍，60℃時增加了3倍。Tajwar等［25］將嗜熱性Clostridium thermocellum的2個碳水化合物結(jié)合模塊（CBM6和CBM22）分別融合到由Thermotoga maritima產(chǎn)生的木聚糖酶XynB的催化域（XynB-C），結(jié)果顯示，修飾后的酶XynB-CB22和XynB-CB6對不溶性樺木木聚糖的活性分別提高了3.24倍和2倍60℃下持續(xù)4 h后，前者的活性保持100%，后者活性損失11%。因此可以確定，從微生物中獲取的天然嗜熱性酶或常溫酶，利用科學(xué)的方法進行適當改性后，其活性和穩(wěn)定性將表現(xiàn)為更加有利于工業(yè)化生產(chǎn)，這在商品酶產(chǎn)量無法增加，價格無法下降的前提下，提高了它的性價比，相當于間接的降低了纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。將來，在深入研究嗜熱性酶的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建基于結(jié)構(gòu)和序列的嗜熱性木質(zhì)纖維素酶模型，將大大加快特定殘基和結(jié)構(gòu)域的靶向修飾，這種方法在改善嗜熱性或嗜溫性酶的特性方面展現(xiàn)出了廣闊的發(fā)展空間。

3.3 嗜熱性木質(zhì)素纖維素酶的固定化

在生物催化過程結(jié)束后，酶的回收率是影響產(chǎn)品成本的另一因素。研究表明，固定化酶比游離酶具有更好的可回收性。此外，酶的固定化也已被證明是在低于最佳條件下提高酶活性和穩(wěn)定性的有效方法之一。有研究人員將漆酶固定在碳納米管上，結(jié)果固定化后的漆酶催化活性大幅度提高。Fernández-Fernández等［26］將 由Myceliophthora thermophila產(chǎn)生的漆酶固定在乙醛-瓊脂糖珠上，從而提高了其在70℃下的活性和熱穩(wěn)定性。Gupta和Bisaria［27］將3種 商 業(yè) 化 的 內(nèi) 切 葡 聚 糖酶（2 800±100 IU/mL），β-葡萄糖苷酶（570±25 IU/mL）和木聚糖酶（4 250±150 IU/mL）通過戊二醛化學(xué)交聯(lián)固定化制備成交聯(lián)酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEA），與游離酶相比，CLEA更穩(wěn)定，在70℃時它們的濾紙酶活性（Filter paper enzyme activity，F(xiàn)PA）、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的半衰期分別比游離酶高出2.30、1.56、3.07和1.67倍。在以羧甲基纖維素和木聚糖為底物的水解過程中，每次水解持續(xù)24 h，溫度控制在70℃，經(jīng)過5個連續(xù)循環(huán)后，CLEA的總體糖化產(chǎn)率為43.3%，而游離酶為31.8%，另外5個循環(huán)后CLEA還保留了77.4%的內(nèi)切葡聚糖酶和85.9%的木聚糖酶活性。同樣，Periyasamy等［28］也把木聚糖酶、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶進行了交聯(lián)固定化，結(jié)果表明，固定化酶具有了更高的熱穩(wěn)定性、回收率和底物水解率。另外，Jia等［29］開發(fā)了一種新型的磁性交聯(lián)纖維素固定化酶聚集體，并將其用于竹子木質(zhì)纖維的生物轉(zhuǎn)化，與游離纖維素酶相比，固定化纖維素酶在更寬的溫度范圍和pH值下顯示出了更好的活性，并且每次水解反應(yīng)完成后，都可以用永磁體對固定化酶分離回收，經(jīng)過6次水解循環(huán)后，其活性仍能保持初始活性的74%。所以，在嗜熱性木質(zhì)纖維素酶產(chǎn)量有限、價格過高的現(xiàn)狀下，利用酶的固定化技術(shù)不僅能夠一定程度上提高酶的活性，還能大大提高酶的利用率，在目前以及將來都不失為一種有效而經(jīng)濟的方法。對于科研人員而言，選擇或開發(fā)具有生物親和性的交聯(lián)載體、研究有利于嗜熱性酶特性交聯(lián)度、探索具有最佳協(xié)同作用的交聯(lián)酶聚集體便成為了纖維素乙醇能源領(lǐng)域下一步的研究重點。

3.4 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的異源表達和代謝調(diào)控

3.4.1 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在嗜溫性宿主中的異源表達 由于嗜熱微生物的最佳環(huán)境條件很難在實驗室中模仿，無法進行大規(guī)模培養(yǎng)，對于工業(yè)應(yīng)用而言，天然產(chǎn)生的嗜熱性酶的產(chǎn)量通常太低，因此將嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在合適的微生物宿主中異源表達非常 必 要。Benedetti等［30］從Thermotoga neapolitana基因組中克隆了兩個編碼半纖維素酶的基因，并在Escherichia coli中表達，結(jié)果不但在正常的培養(yǎng)條件下提高了酶的產(chǎn)量，酶的活性和最適溫度也有所提高。Haq和Akram［31］克隆了超嗜熱真菌Thermotoga naphthophilaRKU-10T的 內(nèi) 切1，4-β-木 聚 糖 酶（TnXynB）基因，構(gòu)建了表達載體pET-21a-TnXynB，并使之在Escherichia coliBL21 CodonPlus中高效穩(wěn)定的過表達，當經(jīng)IPTG（0.5 mmol/L）熱激（42℃21 h）誘導(dǎo)培養(yǎng)（0.8 OD600nm）后，于22℃搖床（200 r/min）培養(yǎng)72 h，觀察到最佳的細胞外TnXynB表達，異源表達的TnXynB蛋白經(jīng)純化23.38倍后，以樺木木聚糖為底物時，在95℃和pH 6.0時表現(xiàn)出最佳催化活性。熱穩(wěn)定性分析表明，異源表達的TnXynB在溫度50-85℃、pH 5.5-8.0的條件下保持8 h活性沒有任何損失，而在pH 4.0-4.5時穩(wěn)定性較差。Han等［32］將來自Chaetomium thermophilum的嗜熱性纖維二糖水解酶CtCel6經(jīng)合理設(shè)計后，使之在Pichia pastoris中過表達，對純化后的異源CtCel6進行酶學(xué)特性測定后發(fā)現(xiàn)，其對β-D-葡聚糖、磷酸溶脹纖維素（PASC）和羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的催化活性分別提高了1.82、1.65和1.43倍，在80℃和90℃下的半衰期（t1/2）分別延長了1.42倍和2.40倍。上述研究表明，嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在嗜溫性宿主中的異源表達不僅可以在常規(guī)條件下提高酶的產(chǎn)量，還能很大程度上提高酶的活性和穩(wěn)定性，而今后如何篩選和優(yōu)化異源表達宿主及其培養(yǎng)條件，以及如何構(gòu)建更加具有適應(yīng)性的表達載體系統(tǒng)將會是科研人員的熱點課題。

3.4.2 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在植物中的異源表達 既然木質(zhì)纖維素的預(yù)處理過程是現(xiàn)階段纖維素乙醇生產(chǎn)的主要經(jīng)濟負擔，目前預(yù)處理的主要思路也是集中在酸解、堿解或酶解等外部方法上，并且這些方法進展也比較緩慢，那么從植物本身入手，通過基因工程技術(shù)在植物組織中異源表達編碼木質(zhì)纖維素降解酶的基因，從而從植物內(nèi)部克服木質(zhì)纖維素的頑固性，以此來實現(xiàn)預(yù)處理過程的經(jīng)濟化，便成為了一種絕妙的替代或輔助方法［33］。不過，嗜溫性酶的植物內(nèi)異源表達可能會導(dǎo)致與細胞內(nèi)毒性有關(guān)的生理問題，如在正常的生長溫度下，會對植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生強烈的負面影響，另外，嗜溫酶的性能參數(shù)與工業(yè)預(yù)處理條件（高溫、極端pH值或有機溶質(zhì)）也不匹配，應(yīng)用效果不太理想，所以，研究人員便進行了嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在植物中的異源表達嘗試。Mir等［34］在擬南芥中表達了密碼子優(yōu)化的重組超嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶（EG）和木聚糖酶（Xyn）基因，結(jié)果顯示，植物生長或產(chǎn)量沒有出現(xiàn)明顯的損失，在轉(zhuǎn)基因擬南芥的干燥莖中觀察到最高的酶活性，表明該酶在莖衰老和貯藏期間未發(fā)生降解，同時，相對于野生型對照植物，來自轉(zhuǎn)基因擬南芥的生物質(zhì)顯示出改善的糖化效率。Castiglia等［35］把編碼嗜熱菌的內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的基因在煙草質(zhì)體中表達，其蛋白得率范圍為總可溶性蛋白（TSP）的2%-75%，其中，內(nèi)切葡聚糖酶的積累（2%TSP）使質(zhì)體發(fā)育受損，出現(xiàn)了幼苗致死表型，內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶經(jīng)熱處理后的產(chǎn)量高達105.4 U/mg和255.4 U/mg，保留了天然嗜熱酶的主要特征，對植物的生長沒有不利影響。當在60℃的溫度下，用質(zhì)體衍生的木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶替代商業(yè)酶進行巨型蘆葦生物質(zhì)水解時，顯示出了比商業(yè)酶更高的水解速率以及木糖和葡萄糖產(chǎn)率。Xiao等［36］在轉(zhuǎn)基因雜交楊中表達了來自Thermotoga neapolitana的嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶（TnCelB），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葉片和發(fā)育中的木質(zhì)部具有較高的TnCelB積累，該部位的木質(zhì)素含量和纖維素結(jié)晶度明顯降低，對生物質(zhì)收獲并進行熱處理后，糖化效率明顯提高。由上可知，植物中異源表達嗜熱性木質(zhì)纖維素酶既可以作為一種獲取嗜熱性酶的來源，還可以從本質(zhì)上改變植物木質(zhì)纖維素的組成含量，減少發(fā)酵前添加外源酶的數(shù)量。在未來的研究中，通過對植物中這種異源表達機制的深入研究，如果能找到更加科學(xué)有效的方法來適度增加植物體內(nèi)這些酶的積累以及減少因表達木質(zhì)纖維素酶而造成的植物毒性，那么這種技術(shù)對纖維素乙醇的商業(yè)化進展將會產(chǎn)生巨大的促進作用。

3.4.3 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的代謝調(diào)控 嗜熱性酶與常規(guī)嗜溫酶一樣，通常是以誘導(dǎo)酶的形式分泌，因此不管是同源表達還是異源表達，它們的產(chǎn)量甚至活性都受到激活和抑制機制的調(diào)節(jié)控制。如果能對這種調(diào)控機制深入研究并加以利用，嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的產(chǎn)量必將大幅度提高，纖維素乙醇的商業(yè)價格也將會具有較大的競爭力。例如，研究發(fā)現(xiàn)在Trichoderma reesei中，含有5個編碼木聚糖酶的基因和16個編碼半纖維素酶的基因，這些基因的表達主要涉及到3個正調(diào)控因子（XYR1，ACE2，HAP2 / 3/5復(fù)合體）和兩個負調(diào)控因子（ACE1，CRE1）［37］。Aghcheh等［38］研究 后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子LAE1和VEL1可以控制纖維素酶的合成，而vel1和lae1的缺失則會導(dǎo)致纖維素酶表達的完全喪失。Zhang等［39］在Trichoderma reeseiRUT C30中引入了人工轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1-cre1b和新型調(diào)控因子Trvib-1，重組后的Trichoderma reeseiVib-1在純纖維素和其他可溶性誘導(dǎo)劑的存在下導(dǎo)致纖維素酶產(chǎn)量增加了兩倍。Sun等［40］把Aspergillus nidulans中負責表達6-磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶（glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT）的 基 因gfaA刪除，然后把來自Volvariella volvacea的調(diào)控因子gfat整合到載體pAL5和自主復(fù)制載體Prg3-AMA1-NotI中以分別構(gòu)建gfat載體pALG和pAMAG，將兩個表達載體轉(zhuǎn)入到A. nidulans后，成功實現(xiàn)了嗜熱性漆酶基因lcs的細胞內(nèi)和細胞外過表達。Jain等［41］為了揭示Cu2+濃度對絲狀真菌相關(guān)木質(zhì)纖維素酶產(chǎn)量的影響，進行相關(guān)研究后發(fā)現(xiàn)，高濃度的銅離子能夠引起微生物生物量的顯著減少，但可以通過激活多種途徑增加纖維素酶、木聚糖酶和漆酶的產(chǎn)量，并通過提高細胞壁的通透性來促進它們的胞外分泌。該研究雖然不是針對嗜熱性酶，但是依據(jù)嗜熱性微生物和嗜溫性微生物代謝途徑的相似性，該研究非常值得借鑒。另外，隨著分子生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的發(fā)展，有研究人員認為，通過引入調(diào)控元件、上調(diào)乙酸鹽途徑和ATP合酶亞基來激活嗜熱性木質(zhì)纖維素酶過表達，可以快速實現(xiàn)商業(yè)酶成本的下降［42-43］。

3.5 嗜熱性木質(zhì)纖維素酶協(xié)同作用

木質(zhì)纖維素的復(fù)雜成分和結(jié)構(gòu)使得單獨一種酶無法實現(xiàn)其完全降解，必須通過多種酶的聯(lián)合使用，才能將其快速高效的轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖。然而，由于自身底物的特異性，屬于不同家族的酶可以顯示出協(xié)同或反協(xié)同作用，通過開展深入研究，優(yōu)化多酶混合物的最佳組合，實現(xiàn)不同酶之間的協(xié)同促進作用，對于提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品收率具有重要意義。Aulitto等［44］以角豆樹為底物對兩種嗜熱酶內(nèi)切1，4-β-甘露聚糖酶（DturCelB）和α-半乳糖苷酶（TtGalA）進行比較協(xié)同研究，研究顯示，當DturCelB和TtGalA以1∶1的組合進行測定時，沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用，以3∶1的組合進行測定時，表現(xiàn)出了一定的的協(xié)同作用，而以瓜爾豆骨架（DturCelB和TtGalA對瓜爾豆的單獨比活度比角豆樹低）為底物時，兩者以1∶1和3∶1進行組合時，都表現(xiàn)出良好的協(xié)同促進作用。Zhou等［45］從嗜熱性微生物Myceliophthora thermophila中得到了一種新型嗜熱性溶解性多糖單加氧酶（MtLPMO9L），與纖維二糖水解酶（CBHI和CBHII）進行協(xié)同實驗后發(fā)現(xiàn)，不同底物情況下MtLPMO9L對CBHI和CBHII表現(xiàn)出了不同的協(xié)同作用。當MtLPMO9L和CBHI的濃度比較低時（1∶10）時，兩者對磷酸膨脹纖維素（PASC）表現(xiàn)出輕微的協(xié)同作用，而當兩種酶的濃度比增加時（10∶1），對PASC和微晶纖維素（Avicel）具有明顯的抑制作用；至于MtLPMO9L和CBHII則在不同濃度時對PASC和Avicel上均觀察到協(xié)同作用，不過與Avicel相比，其對PASC的協(xié)同作用更為明顯。除了類似上述嗜熱性木質(zhì)纖維素酶之間的協(xié)同作用外，有研究發(fā)現(xiàn)［46-47］，輔助水解酶或輔助非水解酶、部分表面活性劑及牛血清白蛋白等對嗜熱性木質(zhì)纖維素酶也具有一定的協(xié)同促進作用。雖然關(guān)于嗜熱性木質(zhì)纖維素酶之間的協(xié)同研究文獻數(shù)量有限，但通過上述研究可以確定，針對不同來源的木質(zhì)纖維素底物，選擇合適的嗜熱酶及確定合適的比例進行聯(lián)合使用，增強嗜熱性酶之間的正協(xié)同作用，必能在一定程度上降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。

4 結(jié)語

綜上所述，纖維素乙醇作為化石能源極具潛力的替代品，其生產(chǎn)過程中存在的技術(shù)瓶頸嚴重限制了它的商業(yè)化步伐。利用嗜溫酶預(yù)處理木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的工藝中，嗜溫酶的高成本和對工業(yè)化生產(chǎn)中極端環(huán)境的不適應(yīng)性，成為了影響纖維素乙醇經(jīng)濟可行性的重要因素之一。嗜熱性木質(zhì)纖維素酶因其更高的熱穩(wěn)定性、更寬pH范圍、更強的抑制劑耐受性、更低的雜菌污染風(fēng)險、更高的反應(yīng)速率以及更低的冷卻成本，在纖維素乙醇生產(chǎn)過程中展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。為了盡早實現(xiàn)嗜熱性木質(zhì)纖維素酶在纖維素乙醇中的商業(yè)化應(yīng)用，科研人員分別從它的篩選、修飾、固定化、異源表達、代謝調(diào)控和協(xié)同作用等不同方向進行了大量研究，并在一定程度上實現(xiàn)了產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性的提高。然而，在嗜熱性木質(zhì)纖維素酶的研究和應(yīng)用過程中還存在許多困難，如固定化酶活性的下降、植物中異源表達時的細胞毒性等。但是，可以相信，隨著研究的不斷深入，這些困難都會逐一解決，纖維素乙醇的商業(yè)競爭力也會得到大幅度提高。