解磷菌JL-1對(duì)磷礦粉降解性能的研究

李文 王陶

（徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221018）

磷是細(xì)胞內(nèi)磷脂、核酸、糖脂及含磷輔酶等的重要組成成分，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)植物體內(nèi)的碳水化合物代謝、氮代謝、能量代謝以及物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)都起著非常重要的作用［1-5］。如果磷素缺乏時(shí)，細(xì)胞的形成和擴(kuò)散會(huì)受到抑制，植物根系生長(zhǎng)會(huì)被限制，因此，農(nóng)作物缺磷輕則產(chǎn)量下降，重則顆粒無(wú)收。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)74%的耕地土壤缺磷［6］，缺磷的主要原因是由于土壤中有效磷很少，絕大部分以無(wú)效磷的方式存在。目前，為了滿足大量農(nóng)作物生長(zhǎng)的需求，需要人為添加磷肥。磷大量存在于礦物或巖石中，主要以羥磷灰石、磷灰石和氧磷灰石等礦質(zhì)形式為主，它們構(gòu)成了磷礦粉的主要成分，這些物質(zhì)為磷肥生產(chǎn)提供了廉價(jià)的原料［7］。但磷肥的利用率卻很低，施入土壤中的磷與Ca2+、Al3+和Fe3+等離子形成不溶性磷酸鹽，很難被植物利用［8］。土壤中不能被植物吸收利用的磷元素會(huì)隨著雨水的沖刷進(jìn)入水中，進(jìn)而造成了水源的污染；在磷肥的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)加入許多重金屬離子，隨著農(nóng)用磷肥的施加這些重金屬等危害元素也會(huì)在土壤里沉積，從而會(huì)導(dǎo)致土壤被重金屬等危害元素污染［9］。如何提高土壤中磷的利用率以及制作出對(duì)環(huán)境友好的新型微生物磷肥是當(dāng)務(wù)之急。

解磷菌是能將植物難以吸收利用的磷元素轉(zhuǎn)化為可被吸收利用形態(tài)的一類微生物，解磷菌對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與環(huán)境保護(hù)有重大意義，有助于農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)改善污染的土壤，是一種環(huán)境友好型微生物肥料。目前已報(bào)道的解磷菌有細(xì)菌、真菌、藻類、放線菌等［10-16］。解磷菌解磷是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，不同的解磷微生物解磷的機(jī)理不同，因此解磷機(jī)制比較復(fù)雜與多樣。解磷微生物降解難溶性磷的機(jī)理多數(shù)是關(guān)于生理生化方面，主要是通過(guò)微生物新陳代謝的產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)，如有機(jī)酸、多糖和質(zhì)子等［17-20］。不同的微生物由于遺傳及代謝的不同，對(duì)于難溶性磷的降解能力也存在差異，即使是同一種解磷菌的解磷能力也會(huì)受到環(huán)境因素如碳、氮源、pH、溫度的影響［21-23］，從而影響其解磷性能。因此，為更好地應(yīng)用解磷菌，對(duì)其解磷性能、解磷條件的研究顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)室篩選到的一株高效解磷新菌株——不動(dòng)桿菌JL-1［10］在磷礦粉的環(huán)境下進(jìn)行解磷性能測(cè)定，磷礦粉的成分復(fù)雜，并含有Al、Fe等多種金屬離子，更難被微生物利用，相較于以磷酸鈣的純品為磷源，磷礦粉更貼近于土壤環(huán)境，更具有現(xiàn)實(shí)意義。優(yōu)化解磷菌JL-1降解磷礦粉磷的解磷條件，并通過(guò)磷礦粉中的磷素釋放量、儲(chǔ)存量和同化量全面評(píng)價(jià)其降解磷礦粉的能力，旨為通過(guò)生物途徑開發(fā)利用磷礦粉研發(fā)新型微生物磷肥奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基 不動(dòng)桿菌（Acinetobacter indicus）JL-1（保存在徐州工程學(xué)院微生物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室）。黃麥嶺磷礦粉：全磷含量（P2O5%）為20%。磷礦粉液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、磷礦粉2 g、（NH4）2SO40.5 g、KCl 0.2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵 母 粉0.5 g、蒸 餾 水1 000 mL，pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。砂培實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g、（NH4）2SO40.5 g、酵母膏0.4 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌25 min。LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g、蛋白胨10 g、牛肉浸膏5 g、蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，使其濃度為18 g/L。

1.1.2 儀器 HYG 旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；TU-1810 紫外-可見分光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 斜面上刮取3環(huán)解磷菌JL-1，接入150 mL LB液體培養(yǎng)基中，將其放置于30℃，150 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，24 h后再按3%的接種量重新接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h后即為種子液。

1.2.2 解磷菌JL-1降解磷礦粉能力測(cè)定 在超凈工作臺(tái)中，在裝有100 mL磷礦粉培養(yǎng)基的錐形瓶中接入1%的種子液，以不接菌為對(duì)照，以接有菌液的磷礦粉培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)置3個(gè)平行，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，每隔24 h，取出培養(yǎng)液，于8 000 r/min離心15 min，檢測(cè)上清的解磷量，通過(guò)鉬藍(lán)比色法測(cè)定解磷量［24］。

1.2.3 解磷菌JL-1對(duì)磷礦粉最適解磷性能研究

1.2.3.1 碳源種類及濃度對(duì)解磷菌降解磷礦粉性能的影響 分別選取羧甲基纖維素鈉、葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉作為碳源，其他條件都不變，對(duì)照組不接菌，接種量1%，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測(cè)定解磷量。采用最佳碳源，改變培養(yǎng)基中碳源濃度為5-25 g/L，梯度為5 g/L，30℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，測(cè)定解磷量。

1.2.3.2 氮源種類及濃度對(duì)解磷菌降解磷礦粉性能的影響 選取無(wú)機(jī)氮源草酸銨、硫酸銨、硝酸鉀，有機(jī)氮源蛋白胨、牛肉膏及酵母粉，不接菌為對(duì)照，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測(cè)定解磷量。

確定最佳無(wú)機(jī)氮源和最佳有機(jī)氮源后，按照質(zhì)量比1∶1將有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源混合，加入磷礦粉培養(yǎng)基中，濃度與單一氮源保持一致，再設(shè)單一的最佳有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源各一組，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測(cè)定解磷量。

在最佳氮源的基礎(chǔ)上，將氮源濃度設(shè)成從0.5-2.5 g/L，梯度為0.5 g/L，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3d，測(cè)定解磷量。

1.2.3.3 磷礦粉添加量對(duì)解磷菌降解磷礦粉性能的影響 改變培養(yǎng)基中的磷礦粉添加量，將其設(shè)為按磷礦粉全磷含量0.2、0.4、0.8、1.2和1.6 g/L，即磷礦粉添加量為1、2、4、6、8 g/L，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測(cè)定解磷量。

1.2.3.4 接種量對(duì)解磷菌降解磷礦粉性能的影響 確定最佳培養(yǎng)基配方后，將接種量設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5%，培養(yǎng)基的組分及培養(yǎng)條件保持不變，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，離心，取上清測(cè)定解磷量。

1.2.3.5 溫度對(duì)解磷菌降解磷礦粉性能的影響 改變磷礦粉培養(yǎng)液的培養(yǎng)溫度分別為26、28、30、37、40℃，培養(yǎng)基的組分及培養(yǎng)條件保持不變，分別在不同溫度，150 r/min，振蕩培養(yǎng)3 d，離心，取上清測(cè)定解磷量。

1.2.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化解磷菌降解磷礦粉條件 以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考，選取3個(gè)較為顯著的影響因素碳源濃度、氮源濃度、接種量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以此來(lái)研究3個(gè)因素的交互作用對(duì)解磷細(xì)菌降解磷礦粉的影響，響應(yīng)面因素水平表見表1。

1.2.4 解磷菌JL-1最適條件下的解磷礦粉時(shí)間曲線

1.2.4.1 解磷菌JL-1活菌數(shù)變化 在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上得到最優(yōu)解磷礦粉培養(yǎng)條件，在此條件下培養(yǎng)84 h，從0 h起，每12 h在超凈工作臺(tái)中取樣，用無(wú)菌水將樣品稀釋至10-7，涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，靜置48 h，記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌落數(shù)，觀測(cè)菌落數(shù)隨時(shí)間變化趨勢(shì)。

1.2.4.2 培養(yǎng)液pH變化的時(shí)間曲線 在最佳降解磷礦粉條件下，每隔12 h取樣測(cè)定培養(yǎng)液的pH，記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH，觀測(cè)pH隨時(shí)間變化趨勢(shì)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

1.2.4.3 培養(yǎng)液磷含量變化曲線 在最佳降解磷礦粉的條件下，每隔12 h取樣，測(cè)定上清的磷含量，觀測(cè)磷含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)。

1.2.5 解磷菌JL-1對(duì)磷礦粉中磷素的釋放量、儲(chǔ)存量及同化量測(cè)定

1.2.5.1 細(xì)砂處理 用10目篩細(xì)細(xì)地篩出砂子，水洗以除去附著土壤，直至水變得澄清后，將篩出的砂子用1%的稀鹽酸浸泡24 h后，用蒸餾水洗至中性，晾干后，準(zhǔn)確稱取6 g 磷礦粉與曬干后的砂子600 g攪拌混合均勻，在150 mL的錐形瓶中準(zhǔn)確稱量50 g混合物，共分裝12瓶，121℃滅菌30 min。

1.2.5.2 砂培 將種子液2 mL分別接入滅菌的細(xì)砂中，并加入8 mL砂培培養(yǎng)基，將12瓶錐形瓶分為3組，每組4瓶，3瓶為平行實(shí)驗(yàn)，1組為不接菌液的空白對(duì)照，在28℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6周。

1.2.5.3 砂培后處理 將培養(yǎng)6周的培養(yǎng)物取出，進(jìn)行下列處理：（1）直接浸提：將4瓶砂土培養(yǎng)物，在錐形瓶中加入0.5 mol/L的NaHCO350 mL振蕩，轉(zhuǎn)速為170 r/min培養(yǎng)30 min，4 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定磷含量；（2）熏蒸處理：將8瓶砂土培養(yǎng)物、50 mL氯仿及50 mL的1 mol/L NaOH放入真空干燥器用泵抽至氯仿沸騰并保持5 min，后密封25℃熏蒸24 h，空泵反復(fù)抽至沒有氯仿味，在錐形瓶中各加入0.5 mol/L的NaHCO350 mL，在轉(zhuǎn)速為170 r/min的條件下振蕩30 min，4 000 r/min離心15 min，取其中1瓶空白對(duì)照，3瓶接菌的上清液測(cè)定磷含量；（3）消煮處理：取剩下4瓶的上清液各5 mL，在上清液中慢慢加入8 mL濃H2SO4，消煮至棕黑色，加30% H2O2數(shù)滴，繼續(xù)消煮至清亮。消煮液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶定容后，測(cè)定消煮液中磷含量［19］。

1.2.5.4 計(jì)算 溶解量以及解磷率按公式（1）、（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中，CP：溶解量，μgP/g磷礦粉；M1：實(shí)驗(yàn)組含磷量，μg；M2：對(duì)照組含磷量，μg；m：磷礦粉的質(zhì)量，g；50：提取液的總體積，mL；V：測(cè)量吸光度用的提取液體積，mL；22.8%：KH2PO4中P所占的百分比。

式中，CP：溶解量，μgP/g磷礦粉；20%：磷礦粉的全磷含量；106：μg到g的換算。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法 每個(gè)試驗(yàn)3次重復(fù)，結(jié)果表示成平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Excel 2010、SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin8.5作圖。

2 結(jié)果

2.1 碳源對(duì)解磷菌JL-1解磷能力的影響

2.1.1 碳源種類對(duì)解磷菌JL-1解磷礦粉能力的影響 碳源是構(gòu)成生物細(xì)胞的主要元素，也是產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)藏物質(zhì)的主要原料。如圖1可知，相較于其他碳源，當(dāng)碳源為蔗糖、葡萄糖時(shí)，解磷量較高，說(shuō)明解磷菌能更好地利用葡萄糖或者蔗糖來(lái)降解磷礦粉，而以葡萄糖為碳源比蔗糖為碳源的解磷量最高，3.78 μg/mL，由此可以確定解磷菌降解磷礦粉的最優(yōu)碳源為葡萄糖。

2.1.2 碳源濃度對(duì)解磷菌JL-1解磷礦粉能力的影響 選取最優(yōu)碳源葡萄糖，考察其濃度對(duì)解磷細(xì)菌降解磷礦粉能力的影響，其結(jié)果如圖2所示，在5-10 g/L的葡萄糖濃度的范圍內(nèi)，解磷量增加緩慢；在10-15 g/L的濃度范圍內(nèi)，解磷量增長(zhǎng)幅度大，在濃度為15 g/L時(shí)，解磷量達(dá)到最高值，為3.83 μg/mL，在15-25 g/L范圍內(nèi)，解磷量逐漸減少。因此，解磷礦粉的最優(yōu)碳源濃度為15 g/L。

2.2 氮源對(duì)解磷菌JL-1解磷能力的影響

2.2.1 不同氮源對(duì)解磷菌JL-1解磷礦粉能力的影響 培養(yǎng)基中的氮源能為微生物生長(zhǎng)所必須的核苷酸、維生素以及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分提供N元素，根據(jù)微生物其生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)選擇合適的氮源，會(huì)增強(qiáng)解磷細(xì)菌降解磷礦粉的能力。

圖3顯示使用單一氮源時(shí)，有機(jī)氮源要高于無(wú)

圖1 碳源種類對(duì)解磷量的影響

圖2 碳源濃度對(duì)解磷量的影響

機(jī)氮源的解磷量，而在有機(jī)氮源的種類中，酵母粉的解磷效果最好，解磷量為3.086 μg/mL，無(wú)機(jī)氮源硫酸銨最佳，而在無(wú)機(jī)氮源中，硫酸銨的解磷效果最好，但低于有機(jī)氮源的解磷量，僅為1.43 μg/mL，將單一氮源變?yōu)橛袡C(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合氮源時(shí)，從圖4可知，按質(zhì)量比1∶1混合硫酸銨與酵母粉時(shí)，解磷量為3.87 μg/mL，明顯高于單一氮源中的解磷量。因此，解磷菌JL-1最優(yōu)氮源為酵母粉和硫酸銨組成的復(fù)合氮源。

2.2.2 氮源濃度對(duì)解磷菌JL-1解磷礦粉能力的影響 影響微生物代謝的一個(gè)重要因素是碳氮比，因此不同的氮源濃度對(duì)菌株解磷能力有很大影響［19］。由圖5可知，解磷量在復(fù)合氮源濃度0.5-1.0 g/L的范圍內(nèi)解磷顯著增加，在氮源濃度為1.0 g/L時(shí)達(dá)到最高，為4.08 μg/mL，而在1.0-2.5 g/L范圍內(nèi)逐漸降低，因此，解磷菌JL-1的最適氮源濃度為1.0 g/L。

2.3 磷礦粉添加量對(duì)解磷菌JL-1降解磷礦粉能力的影響

磷礦粉添加量對(duì)解磷量影響如圖6所示，當(dāng)磷

圖3 單一氮源對(duì)解磷量的影響

圖4 復(fù)合氮源對(duì)解磷量的影響

圖5 氮源濃度對(duì)解磷量的影響

礦粉的添加量在1-2 g/L時(shí)，解磷量在增加，而添加量在2-8 g/L時(shí)，解磷量穩(wěn)定在4.0 μg/mL左右，這表明解磷菌JL-1在降解磷礦粉時(shí)，所釋放的有機(jī)酸與酶有限，只能降解一定量的磷礦粉，所以當(dāng)添加量大于2 g/L時(shí)，解磷量變得穩(wěn)定。

2.4 接種量對(duì)解磷菌JL-1解磷能力的影響

接種量的大小決定于菌種的生產(chǎn)繁殖速度，若用較大的接種量，可以縮短菌種繁殖達(dá)到最高峰的時(shí)間，并且解磷細(xì)菌能夠迅速成為培養(yǎng)環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌種，從而減少雜菌生長(zhǎng)的可能性。如果接種量過(guò)多，菌種生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)環(huán)境中的養(yǎng)分以及氧氣供給不足，會(huì)造成菌種過(guò)快死亡，影響解磷菌降解磷礦粉的效果。

圖6 磷礦粉添加量對(duì)解磷量的影響

從圖7可以看出，解磷量在0.5%-1%接種量之間迅速上升，在接種量為1%時(shí)達(dá)到頂峰，為4.18 μg/mL，由此可以看出，當(dāng)接種量為1%時(shí)，解磷細(xì)菌降解磷礦粉的效果比較好。

圖7 接種量對(duì)解磷量的影響

2.5 pH值對(duì)解磷菌JL-1解磷能力的影響

微生物生長(zhǎng)的最適pH值在6-8之間，不同的微生物都有其最適宜的pH，外界環(huán)境的pH會(huì)影響細(xì)胞膜上的蛋白以及釋放到胞外的酶的活性，從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收，環(huán)境的pH還會(huì)影響培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解。因此選擇最佳的pH，有助于解磷細(xì)菌更好地降解磷礦粉，考察pH對(duì)解磷菌降解磷礦粉能力的影響。

從圖8可以看出，當(dāng)初始pH值在5.5-7.0時(shí)，解磷量在逐步升高，而當(dāng)初始pH大于7.0時(shí)，解磷量逐漸降低，所以解磷菌JL-1最適pH為7.0，解磷量為4.20 μg/mL，由此可以看出在初始pH在中性是有利于解磷細(xì)菌降解磷礦粉。

2.6 溫度對(duì)解磷菌JL-1解磷能力的影響

圖8 pH對(duì)解磷量的影響

溫度影響微生物生長(zhǎng)和代謝的環(huán)境條件中的一個(gè)重要因素之一，溫度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理代謝，過(guò)低的溫度會(huì)使菌種進(jìn)入休眠狀態(tài)，會(huì)影響發(fā)酵的效果。所以適宜的溫度會(huì)加快解磷菌降解磷礦粉的進(jìn)程。

圖9顯示，在26-28℃之間，解磷量在上升，且上升幅度較大，而從28-40℃，解磷量逐步下降，在28℃最高達(dá)到最高，為4.45 μg/mL，由此可以確定在28℃時(shí)，解磷細(xì)菌降解磷礦粉的效果最好。

圖9 溫度對(duì)解磷量的影響

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化解磷菌JL-1對(duì)磷礦粉的解磷條件

依據(jù)前面單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取解磷菌JL-1解磷過(guò)程中影響較大的因素碳源濃度、氮源濃度、接種量來(lái)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。結(jié)果見表2。

根據(jù)表2，解磷量為響應(yīng)值，經(jīng)軟件擬合，得到各因素對(duì)解磷量的回歸方程。用編碼表示：

解磷量=4.55+0.21A+0.12B+0.041C+0.093AB-0.089BC-0.37A2-0.23B2-0.30C2

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3。

從表3可以看出，模型設(shè)計(jì)中，其F值為24.36，說(shuō)明了該模型顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)可信；這個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠥C對(duì)解磷量的影響顯著（P＜0.05）且A、B、A2、B2、C2對(duì)解磷量的影響極顯著（P＜0.01），說(shuō)明了葡萄糖濃度、接種量以及氮源濃度三者之間存在交互作用，彼此之間互相影響。失擬項(xiàng)P=0.471 0＞0.05，說(shuō)明該模型失擬不顯著，方程能夠反映出解磷量與碳源濃度、氮源濃度以及接種量之間的關(guān)系，回歸方程的校正系數(shù)R2adj=0.929 3（＞0.90），表明了此方程的擬合度為92.93%，擬合度良好，較接近R2。因此，解磷量能夠通過(guò)此模型進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)，從單個(gè)因素的F值大小可知，3個(gè)因素對(duì)解磷量的影響大小的順序?yàn)椋浩咸烟菨舛龋镜礉舛龋窘臃N量。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

圖10-A等高線近似橢圓形，所以葡萄糖濃度和接種量之間的相互作用較強(qiáng)，這一組合對(duì)解磷量的影響顯著。圖10-B顯示了葡萄糖濃度與接種量之間的交互作用，可以看出響應(yīng)面曲面的坡度比較陡峭，說(shuō)明解磷量對(duì)葡萄糖濃度和接種量的變化比較敏感。

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，得到試驗(yàn)條件：葡萄糖濃度16.69 g/L、氮源濃度1.15 g/L、接種量1.05%，此時(shí)解磷量理論值為4.60 μg/mL。分析該方程得到最佳發(fā)酵條件為，為了方便實(shí)驗(yàn)，選取葡萄糖濃度17 g/L，氮源濃度1.2 g/L，接種量1%，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得解磷量的平均值為4.65 μg/mL，與預(yù)測(cè)值相近，證明了響應(yīng)面模型的可靠性。

表3 方差分析表

2.8 解磷菌JL-1降解磷礦粉的時(shí)間曲線

在最佳發(fā)酵條件下，動(dòng)態(tài)檢測(cè)84 h內(nèi)解磷菌發(fā)酵的磷含量、pH及解磷菌生長(zhǎng)情況，了解解磷菌降解磷礦粉的發(fā)酵過(guò)程。圖11顯示，解磷菌在12 h后快速增長(zhǎng)，在60 h時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最高值，為10.65 log（CFU/mL），之后稍有下降，pH值在0-60 h持續(xù)降低，在60 h將至最低，而解磷量在0-60 h之間持續(xù)上漲，解磷量在60 h達(dá)到最大，為4.65 μg/mL，此時(shí)的溶磷率為2.34%，說(shuō)明在60 h時(shí)，菌落數(shù)持續(xù)增長(zhǎng)，菌的代謝產(chǎn)物使得發(fā)酵液的pH下降，可能同時(shí)在解磷菌所釋放的酶的共同作用下，使磷礦粉降解，在60 h后菌落數(shù)開始下降，pH也稍有回升，同時(shí)解磷量也稍有下降，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐步減少，使得菌開始死亡，且此時(shí)解磷菌可能開始同化利用發(fā)酵液中的磷為維持生命活動(dòng)活動(dòng)所需，所以解磷量有所減少。

2.9 解磷菌JL-1對(duì)磷礦粉釋放、儲(chǔ)存及同化能力的測(cè)定

圖10 降解參數(shù)交互作用對(duì)磷礦粉解磷特性的影響

圖11 解磷菌降解磷礦粉時(shí)間曲線

經(jīng)過(guò)6周的砂土培養(yǎng)，將樣品進(jìn)行浸提、熏蒸、消煮處理后，結(jié)果見表4，可以看出3組樣品在經(jīng)過(guò)3個(gè)處理之后，直接浸提溶磷量最低，為115.33 μgP/g磷礦粉，直接浸提測(cè)得的是微生物溶解磷礦粉為有效磷后，直接釋放到體外的解量；經(jīng)過(guò)熏蒸處理后的溶磷量為127.54 μgP/g磷礦粉，大于直接浸提的含磷量，這說(shuō)明解磷細(xì)菌在降解磷礦粉的過(guò)程中，并不是將所有的磷都是釋放到體外，微生物會(huì)將一部分磷以可溶性磷酸鹽的方式儲(chǔ)存在體內(nèi)，以滿足微生物自身生長(zhǎng)需要，熏蒸處理過(guò)后，細(xì)菌的細(xì)胞會(huì)破碎，儲(chǔ)存在細(xì)胞體內(nèi)的磷酸鹽會(huì)釋放出來(lái)，因此，熏蒸的含磷量包括直接釋放的磷量以及儲(chǔ)存在體內(nèi)的磷量，比直接浸提的高；消煮處理過(guò)后的含磷量比熏蒸處理以及直接浸提的要高，為160.09 μgP/g磷礦粉，這說(shuō)明解磷細(xì)菌在溶解磷礦粉的時(shí)候除了會(huì)釋放到體外，以及在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存一部分外，還有一部分會(huì)被微生物同化，參與自身代謝，經(jīng)過(guò)消煮處理后，這部分磷會(huì)釋放出來(lái)，所以消煮處理的溶磷量最高。

表4 三個(gè)處理的解磷情況

釋放量、儲(chǔ)存量及同化量之間的關(guān)系見表5，釋放量為115.33 μgP/g磷礦粉，占總解磷量的72.08%，可見，解磷菌JL-1溶解磷礦粉后會(huì)將大部分的磷直接釋放出來(lái)；儲(chǔ)存量較低，為12.21 μgP/g磷礦粉，占據(jù)總解磷量的7.63%，同化量為32.55μgP/g磷礦粉，占總解磷量的20.29%，總解磷量占磷礦粉全磷的0.08%。因此，解磷菌JL-1J將磷礦粉溶解為有效磷時(shí)，會(huì)將大部分磷直接釋放到周圍環(huán)境，少部分會(huì)被微生物同化，參與代謝，極小部分會(huì)以可溶性磷酸鹽形式儲(chǔ)存在體內(nèi)。

表5 釋放量、儲(chǔ)存量、同化量的關(guān)系

3 討論

我國(guó)磷礦粉資源較為豐富，20世紀(jì)四十年代即有施磷礦粉于田間的報(bào)道［25］，而其中大部分為無(wú)效磷，解磷微生物可以活化難溶磷，來(lái)提高磷礦粉的田間使用效果，因此測(cè)定解磷菌對(duì)于磷礦粉的降解性能將更有利于確定該解磷菌的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。已發(fā)現(xiàn)多種微生物如細(xì)菌、真菌、藍(lán)細(xì)菌等對(duì)磷礦粉有溶解作用［26-30］，但尚未見不動(dòng)桿菌降解磷礦粉的報(bào)道，在最優(yōu)條件下，不動(dòng)桿菌JL-1在磷礦粉培養(yǎng)基中60 h達(dá)最大解磷量為4.65 μg/mL，溶磷率為2.34%，這與已報(bào)道的一些溶磷效果較好的細(xì)菌的溶磷率接近。如假單胞細(xì)菌2VCP1對(duì)6種不同磷礦粉的溶磷率為1.0%-2.73%；節(jié)細(xì)菌1TCRi7的溶磷率為0.55%-2.55%［30］；東祁連山高寒草地的解磷細(xì)菌歐文氏菌Y2、假單胞桿菌Y3、沙雷氏菌Y4對(duì)3種磷礦粉的解磷率最低為0.03%，最高為4.74%，不同磷礦粉組成的差異及菌株代謝特征，如菌株產(chǎn)生的有機(jī)酸種類與濃度和體系最終pH值的差異等均可能導(dǎo)致解磷率的不同［31］。因此，該研究一定程度上豐富了降解磷礦粉的解磷菌資源。

對(duì)于特定的解磷菌而言，想要發(fā)揮其最大的解磷功效，有必要對(duì)其解磷條件進(jìn)行優(yōu)化，提高其解磷能力，從而促進(jìn)微生物在磷礦中的應(yīng)用，這方面的研究已成為開發(fā)利用解磷菌過(guò)程中的熱點(diǎn)。碳源、氮源作為微生物必不可少的能源物質(zhì)，其種類和濃度會(huì)對(duì)解磷菌的生長(zhǎng)代謝以及溶解磷礦粉的能力產(chǎn)生影響［32］?？麓毫恋龋?3］的研究結(jié)果表明，內(nèi)生沙雷氏菌 M-3-01解磷礦粉能力受到碳源、氮源種類及質(zhì)量濃度影響明顯，降解磷礦粉時(shí)的最優(yōu)碳源為葡萄糖，質(zhì)量濃度 15 g/L；最優(yōu)氮源為草酸銨，質(zhì)量濃度 1.5 g/L。肖春橋等［33］研究巨大芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌對(duì)磷礦中的磷的浸出能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，碳源葡萄糖和氮源硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%時(shí)磷的浸出率最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高或過(guò)低均抑制了磷的浸出。與上述研究相比，不動(dòng)桿菌的最優(yōu)碳源與其一致；最優(yōu)無(wú)機(jī)氮源為硫酸銨，與芽孢桿菌的一致，一些研究認(rèn)為銨態(tài)氮是解磷微生物的必須氮源，銨態(tài)氮作為氮源時(shí)，解磷菌對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解量高于硝態(tài)氮［34-35］，這與本研究一致，且本研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源復(fù)合時(shí)，解磷能力高于單一無(wú)機(jī)氮源的作用，可能是由于有機(jī)氮存在時(shí)，能進(jìn)一步促進(jìn)菌的生長(zhǎng)與代謝。雖然不同菌種間的最適氮源和氮源濃度存在差異，但氮源濃度和氮源濃度對(duì)菌株解磷礦粉的影響較為一致，都表現(xiàn)為在低濃度范圍內(nèi)，隨培養(yǎng)液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，解磷量增加，這可能是由于培養(yǎng)液中合適的碳氮源濃度有利于解磷菌的生產(chǎn)、代謝，質(zhì)子和有機(jī)酸的產(chǎn)量提高，從而提高解磷量，但當(dāng)碳源和氮源過(guò)量時(shí)，可能會(huì)提高培養(yǎng)液的滲透壓，抑或反饋抑制相關(guān)酶的活性，使解磷率降低。

磷礦粉濃度對(duì)不動(dòng)桿菌的解磷能力有一定的影響，實(shí)驗(yàn)表明，磷礦粉最優(yōu)濃度為2 g/L，繼續(xù)增大磷礦粉的濃度，解磷量基本保持不變，說(shuō)明菌株對(duì)于磷礦粉的降解能力有一定限度，有研究表明，磷礦粉質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時(shí)，磷礦粉質(zhì)量濃度與解磷菌菌株的解磷能力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［30］，因此在降解磷礦粉時(shí)，應(yīng)根據(jù)菌株對(duì)磷礦粉的敏感程度，選擇適合的磷礦粉的濃度。此外，不動(dòng)桿菌JL-1的解磷能力還與接菌量、pH、溫度等因素相關(guān)，接菌量決定了能作用于磷礦粉的微生物數(shù)量，最適pH值、溫度的確定可為選擇磷礦粉施用地的土壤類型、酸堿度、環(huán)境溫度提供一定的實(shí)踐指導(dǎo)，在磷礦粉田間最佳施用條件下，巨大芽孢桿菌P17將發(fā)揮其最大的解磷功效，從而更有效地改善土壤磷素營(yíng)養(yǎng)、提高磷礦粉的利用率。

為全面地反映不動(dòng)桿菌JL-1解磷的實(shí)際能力，采用砂培實(shí)驗(yàn)，對(duì)砂培產(chǎn)物分別進(jìn)行直接浸提、熏蒸、消煮的方法，依次測(cè)定JL-1菌體所釋放、儲(chǔ)存和同化的磷素，繼而得到菌體對(duì)磷礦粉的轉(zhuǎn)化能力、效率，及各種磷素形式所占其總解磷量的比例。結(jié)果表明菌株溶解磷礦粉后，會(huì)釋放大部分磷（72.08%），并固定小部分磷（27.92%）。對(duì)于不同的微生物而言，釋放部分和固定部分所占的比例不盡相同，如東祁連山的4株解磷細(xì)菌Y1-Y4對(duì)于黃麥嶺磷礦粉的釋放量占總解磷量的比例為10.16%-51.20%不等［31］，皆低于不動(dòng)桿菌JL-1的釋放比例。此外，菌株固定磷的形式也會(huì)存在差異，有些細(xì)菌會(huì)將有效磷同化吸收為有機(jī)磷，用于自身的生長(zhǎng)代謝，另一些則對(duì)分解出來(lái)的無(wú)機(jī)磷酸鹽進(jìn)行吸收，在細(xì)胞內(nèi)貯藏大量的無(wú)機(jī)磷酸鹽，而這兩者的相對(duì)比例也會(huì)有所不同，不動(dòng)桿菌JL-1對(duì)磷的固定主要采取同化的方式，這可能是由不同微生物的遺傳特征不同，或是磷礦粉之間存在差異造成的。無(wú)論哪種形式，這部分固定的磷在菌體死亡后，大部分都會(huì)以有效磷的形式釋放到環(huán)境中供植物利用，因此，微生物菌體可認(rèn)為是暫時(shí)的磷庫(kù)?？傮w看說(shuō)，不動(dòng)桿菌JL-1總解磷量占全磷量的比例為0.08%，高于葉震［31］所研究的4種細(xì)菌對(duì)3種不同磷礦粉的解磷效果，具有較好的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

不動(dòng)桿菌JL-1對(duì)磷礦粉的降解能力與其遺傳特性、生長(zhǎng)條件、環(huán)境條件密切相關(guān)，在最優(yōu)的解磷礦粉條件下，該菌株具備較好的解磷礦粉性能，砂培實(shí)驗(yàn)表明該菌株在解磷礦的過(guò)程中可以直接釋放大部分磷素、固定少部分磷素。下一步可以在田間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)定其解磷性能及對(duì)于作物增產(chǎn)的作用。此外，探索解磷菌JL-1降解磷礦粉的分子、遺傳機(jī)制，研究其與其他微生物的相互作用關(guān)系，為以后研發(fā)環(huán)保高效的微生物磷肥奠定一定理論基礎(chǔ)。