Nrf2點(diǎn)突變穩(wěn)轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定

張琳琳，賈 維*，鄭翠俠

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082；2.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院，上海 200082）

關(guān)鍵字：Nrf2；點(diǎn)突變；肺癌；逆病毒載體

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居世界第一。大量研究表明，Nrf2-ARE信號(hào)通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Keap1在細(xì)胞質(zhì)中以二聚體形式與Nrf2結(jié)合，使之成為E3泛素連接酶的適配底物，促進(jìn)Nrf2泛素化降解，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解，使Nrf2處于一種非活性狀態(tài)。當(dāng)受到外界有害刺激及氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1解離和釋放，同時(shí)減弱Keap1介導(dǎo)的蛋白酶對(duì)Nrf2的降解作用[1]。Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)增多，并與Maf蛋白形成異二聚體，啟動(dòng)Nrf2下游II相解毒酶和抗氧化蛋白等靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞解毒及清除有害物質(zhì)的能力[2]。但Nrf2持續(xù)性異常活躍又有助于癌細(xì)胞生長(zhǎng)，降低其對(duì)化療藥物的敏感性[3]。在人類肺癌組織中存在Nrf2突變，該突變可使Keap1-Nrf2/ARE通路異常活化，使Nrf2蛋白表達(dá)高于基礎(chǔ)水平，與臨床上肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)利用逆病毒系統(tǒng)，構(gòu)建Nrf2點(diǎn)突變穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究Nrf2基因突變?cè)诜伟┲械淖饔锰峁┘?xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 人肺腺癌細(xì)胞株A549、人胚腎細(xì)胞株293T（上海中科院）；pMSCV逆病毒載體及包裝質(zhì)粒gag-pol、pVSVG（本課題組實(shí)驗(yàn)室）；限制性內(nèi)切酶、載體連接試劑盒Ver.2.1、GXL長(zhǎng)鏈高保真試劑盒（寶日醫(yī)生物工程有限公司）；DNA純化試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；DH5a感受態(tài)細(xì)胞、定點(diǎn)誘變?cè)噭┖小GEM-Teasy載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；Lipofectamine?2000試劑、氨芐抗生素培養(yǎng)基及平板、Opti-MEM培養(yǎng)液（美國(guó)Invitrogen公司）；高糖培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)基、Ham’s F-12K（Kaighm’s）培養(yǎng)基、高糖 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶（上海源培生物科技有限公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Nrf2-Teasy質(zhì)粒構(gòu)建 利用Trizol法提取293T細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為CDNA。以CDNA為模板通過(guò)PCR方法擴(kuò)增Nrf2目的基因。Nrf2引物如下：Nrf2-F:5’-ATGGATTTGATTGACATACTTTGG-3’Nrf2-R:5’-CTAGTTTTTCTTAACATCTGGCTTCTTA-3’擴(kuò)增產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖核酸電泳，紫外燈下切膠回收目的條帶。PCR割膠回收產(chǎn)物加poly A尾后用10×ligase buffer 4 ℃過(guò)夜與Teasy載體連接。利用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，而后在固體LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑單克隆，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，菌液小抽后將分子量大小正確的質(zhì)粒送去測(cè)序。

1.2.2 Nrf2-MUT-Teasy（突變型Nrf2）質(zhì)粒的構(gòu)建 用全式金的Fast Mutagenesis System對(duì)Nrf2進(jìn)行定點(diǎn)誘變，使其第2號(hào)外顯子有T35C和G37A的點(diǎn)突變。

上游引物：

下游引物：

DMT消化PCR產(chǎn)物，37 ℃孵育1 h。轉(zhuǎn)化過(guò)夜，挑克隆，搖菌，小抽，送測(cè)序。

1.2.3 構(gòu)建pMSCV-Nrf2-T35C-3f lag，pMSCV-Nrf2-G37A-3f lag逆病毒質(zhì)粒 以構(gòu)好的Nrf2-Teasy質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)Xho1和Hpa1雙酶切引物，PCR擴(kuò)增點(diǎn)突變的Nrf2基因。

上游引物：

下游引物：

目的片段與pMSCV載體同時(shí)做雙酶切，連接轉(zhuǎn)化，小抽后做雙酶切跑膠鑒定，把分子量大小正確的質(zhì)粒送測(cè)序。

1.2.4 逆病毒的包裝與轉(zhuǎn)染 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，每6 cm培養(yǎng)皿中接種3×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)過(guò)夜。將上述慢病毒表達(dá)載體3 μg、gag-pol 3 μg和p-VSVG 2 μg，加入不含血清和抗生素的250 μL opti-MEM溶液中；另取不含血清和抗生素的250 μL opti-MEM中加入16 μL Lipofectamine2000，室溫靜置 5 min。均勻混合2種液體，室溫靜置20 min后逐滴加入培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染6 h后換成完全培養(yǎng)基，48 h后收病毒。將4 mL病毒液與1 mL正常培液加入8 μg/μL的poly-brene混勻，加入A549肺癌細(xì)胞，感染8 h后換液，48 h后puro藥篩，得到穩(wěn)定感染細(xì)胞。

1.3 RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)量 提取細(xì)胞樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為CDNA。樣品中目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量采用RT-PCR檢測(cè)。分析RT-PCR反應(yīng)曲線，獲得各個(gè)樣品目的基因和內(nèi)參基因的域值循環(huán)數(shù)（ct值）相對(duì)定量后采用△△CT計(jì)算。參照樣品為未感染逆病毒的靶細(xì)胞。目的基因的引物序列(5＇to 3＇) 如下：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)進(jìn)行2組獨(dú)立樣本比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組載體鑒定 Nrf2-Teasy質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定，陽(yáng)性克隆條帶大小為1 770 bp，進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為測(cè)通。使用測(cè)序峰圖閱讀器Chromas軟件鑒定測(cè)序結(jié)果，結(jié)果（圖1），目的基因正確插入Teasy載體。

圖1 重組Nrf2-Teasy質(zhì)粒鑒定

2.2 質(zhì)粒鑒定 構(gòu)建pMSCV-MUT-3f lag重組質(zhì)粒后，進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為1.7 kb，結(jié)果顯示目的條帶位置正確（圖2）。酶切鑒定：重組質(zhì)粒經(jīng)Xho1和Hpa1雙酶切鑒定后，在1.7 kb處可見到目的基因Nrf2片段，在7.6 kb處可見到pMSCV片段,與預(yù)期一致。從重組逆病毒樣品中可以檢測(cè)到Nrf2的條帶，表明目的基因已成功整合在病毒基因組中（圖3）。將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank中Nrf2序列比對(duì)驗(yàn)證，結(jié)果點(diǎn)突變與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功（圖4）。

圖2 Nrf2點(diǎn)突變基因片段

圖3 pMSCV-MUT-Nrf2重組質(zhì)粒

圖4 兩質(zhì)粒測(cè)序峰圖

2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)株鑒定 將pMSCV-MUT-3f lag病毒包裝后感染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡見熒光表達(dá)結(jié)果較強(qiáng)（圖5）。細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯熒光，說(shuō)明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常，熒光標(biāo)記基因表達(dá)正常。將病毒液感染A549細(xì)胞48 h后GFP的表達(dá)情況（圖6），表示Nrf2蛋白可以在A549細(xì)胞中表達(dá)。

圖5 熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞后GFP的表達(dá)（100×）

圖6 逆病毒感染A549人肺癌細(xì)胞（200×）

2.4 RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平 將病毒液加入A549細(xì)胞，獲得穩(wěn)定感染的A549肺癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，利用RT-PCR法檢測(cè)Nrf2 mRNA的表達(dá)水平，所得結(jié)果與Nrf2野生型（wt）相比較，可見基因突變組Nrf2基因表達(dá)豐度與對(duì)照組相比明顯升高（圖7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖7 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（P ＜0.05）

有多項(xiàng)研究表明在肺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌[5-8]等腫瘤組織中Nrf2表達(dá)水平較高，Nrf2的異常激活可引起Nrf2在癌細(xì)胞中的積聚，導(dǎo)致Nrf2下游產(chǎn)物增多。Nrf2下游基因的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)癌細(xì)胞抗損傷作用，降低其對(duì)化療藥物如依托泊苷、卡鉑、順鉑、5-氟尿嘧啶和多柔比星的敏感性[9-10]。Nrf2/Keap1的體細(xì)胞突變是使Nrf2異常激活的主要途徑。突變均存在于Nrf2和Keap1相互作用的Neh2域附近或內(nèi)部[11-12]。在生理情況下，Nrf2通過(guò)與Keap1結(jié)合而保持轉(zhuǎn)錄活性，并可及時(shí)被泛素蛋白酶系統(tǒng)降解。當(dāng)突變發(fā)生，影響到Keap1與Nrf2的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，可造成Nrf2-Keap1通路活性增強(qiáng)，突變的細(xì)胞可從被過(guò)度激活的該途徑中獲益，以逃避內(nèi)源性的腫瘤抑制作用[13-14]。

本研究通過(guò)定點(diǎn)誘變及逆病毒方式構(gòu)建A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，而后應(yīng)用熒光顯微鏡和RT-PCR方法檢測(cè)Nrf2基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)測(cè)序結(jié)果顯示，Nrf2突變位點(diǎn)正確，表明Nrf2突變逆病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)而將測(cè)序無(wú)誤的質(zhì)粒，構(gòu)建A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Nrf2表達(dá)量，結(jié)果顯示突變組細(xì)胞Nrf2表達(dá)量顯著高于wt對(duì)照組，說(shuō)明本研究制備的Nrf2點(diǎn)突變逆病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。其將為深入研究Nrf2突變?cè)诜伟┌l(fā)病中的作用以及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。