白花九里明提取物中3種有機(jī)酸及總黃酮、總有機(jī)酸的含量測(cè)定

韓 璐，黃薏霏，那襲雪，張文濤，宋 丹，楊 宏，寧小清，*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西南寧市婦幼保健院，廣西 南寧 530000)

壯藥白花九里明來源于菊科艾納香屬植物東風(fēng)草(Blumeamegacephala(Randeria)Chang et Tseng)的地上部分[1]。研究表明，白花九里明藥材含有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸[2]以及有機(jī)酸、黃酮類化合物等止血成分[3]；白花九里明提取物對(duì)小鼠子宮平滑肌具有明顯收縮作用[4]。為了進(jìn)一步弄清白花九里明提取物中的有效成分及其含量，作者采用高效液相色譜法和酶標(biāo)法對(duì)提取物中的原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、總黃酮[5-6]、總有機(jī)酸[7]的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥材、試劑與儀器

白花九里明藥材，采自南寧市郊，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院寧小清高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為菊科艾納香屬植物東風(fēng)草(Blumeamegacephala(Randeria)Chang et Tseng)的地上部分。

原兒茶酸對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、咖啡酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸，色譜純；甲醇、乙醇，分析純；超純水。

e2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore；P300H型中型超聲波清洗機(jī)，德國(guó)Elma Schmidbauer GmbH；Infinite M200PRO型光吸收微孔板檢測(cè)儀，奧地利Tecan Austrla GmbH。

1.2 白花九里明提取物的制備

取干燥的白花九里明藥材1.5 kg，加水超聲提取，過濾；濾液濃縮后加入乙醇使醇含量為70%～85%，靜置，過濾，濾液干燥后即得白花九里明提取物146.25 g。

1.3 色譜條件

Inert Sustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙睛-0.1%磷酸(8∶92，體積比，下同)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm和327 nm：0～10 min，327 nm；10～20 min，250 nm；20～45 min，327 nm。典型圖譜見圖1。

圖1 對(duì)照品(a)和白花九里明提取物(b)的HPLC圖譜

1.4 對(duì)照溶液的制備

分別精密稱取原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸對(duì)照品適量，配成3種有機(jī)酸質(zhì)量濃度分別為0.174 mg·mL-1、0.200 mg·mL-1、0.071 mg·mL-1的混合對(duì)照溶液，供HPLC分析使用；精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，配成0.082 4 mg·mL-1槲皮素對(duì)照溶液，供酶標(biāo)分析使用；精密稱取原兒茶酸對(duì)照品適量，配成0.216 mg·mL-1原兒茶酸對(duì)照溶液，供酶標(biāo)分析使用。

1.5 供試溶液的制備

精密稱取白花九里明提取物約0.5 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，超聲10 min后于3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液，供HPLC分析使用。

精密稱取白花九里明提取物70 mg，置于100 mL容量瓶中，加入1%三氯化鋁溶液4 mL，用70%甲醇定容，供酶標(biāo)法測(cè)總黃酮使用。

精密稱取白花九里明提取物70 mg，置于100 mL容量瓶中，加入50%甲醇60 mL、0.3%SDS溶液20 mL、1%鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液10 mL，用0.1 mol·L-1HCl溶液定容，供酶標(biāo)法測(cè)總有機(jī)酸使用。

2 結(jié)果與討論

2.1 原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸的含量測(cè)定

2.1.1 線性關(guān)系

取混合對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL,按色譜條件測(cè)定, 記錄峰面積。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程：原兒茶酸：y=3247876.3x-161259.7(R2=0.9999)，線性范圍0.348～3.132 μg；綠原酸：y=2366620.2x-153803.1(R2=0.9999)，線性范圍0.4～3.6 μg；咖啡酸：y=2138932.2x-76685.8(R2=0.9999)，線性范圍0.142～1.278 μg。

2.1.2 精密度

精密吸取混合對(duì)照溶液10 μL, 按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.39%、0.40%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

精密吸取供試溶液，按色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD分別為1.72%、0.78%、1.82%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.4 重復(fù)性

精密稱取同一供試品6份, 按1.5方法制備供試溶液, 按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸峰面積的RSD(n=6)分別為1.77%、0.98%、1.60%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率

按1.5方法平行制備6份供試溶液，每份精密加入原兒茶酸對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、咖啡酸對(duì)照品0.696 mg、1.000 mg、0.210 mg，制成樣品溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

從表1可知，原兒茶酸平均加標(biāo)回收率為98.07%，RSD為1.35%；綠原酸平均加標(biāo)回收率為97.49%，RSD為1.42%；咖啡酸平均加標(biāo)回收率為99.81%，RSD為0.43%。

表1 3種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率(n=6)

2.1.6 含量測(cè)定

根據(jù)方法學(xué)考察, 原兒茶酸在0.348～3.132 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；綠原酸在0.4～3.6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；咖啡酸在0.142～1.278 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加標(biāo)回收率的RSD值均符合含量測(cè)定要求。測(cè)得白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的含量分別為1.29 mg·g-1、3.68 mg·g-1、0.81 mg·g-1。

2.2 總黃酮的含量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系

精密量取槲皮素對(duì)照溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加入4 mL 1%的三氯化鋁溶液，用70%甲醇定容，吸取100 μL，測(cè)定溶液在373 nm處吸光度。以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、槲皮素濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得槲皮素線性回歸方程為：y=10.933x-0.0151(R2=0.9998)，線性范圍8.24～41.20 μg·mL-1。

2.2.2 精密度

精密量取槲皮素對(duì)照溶液100 μL，連續(xù)檢測(cè)6次。計(jì)算RSD(n=6)為0.171%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性

精密稱取同一供試品6份，按1.5方法制備供試溶液，取100 μL檢測(cè)。計(jì)算RSD(n=6)為0.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性

精密量取供試溶液100 μL，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測(cè)。計(jì)算RSD為2.14%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.5 加標(biāo)回收率

精密稱取供試品35 mg，按1.5方法平行制備6份供試溶液，精密加入0.78 mg槲皮素對(duì)照品，制成樣品溶液。精密量取各樣品溶液100 μL檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

表2 槲皮素的加標(biāo)回收率(n=6)

從表2可知，槲皮素的平均加標(biāo)回收率為102.4%，RSD為0.75%。

2.2.6 含量測(cè)定

根據(jù)方法學(xué)考察, 槲皮素在8.24～41.20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。測(cè)得白花九里明提取物中總黃酮含量為22.33 mg·g-1。

2.3 總有機(jī)酸的含量測(cè)定

2.3.1 線性關(guān)系

精密量取原兒茶酸對(duì)照溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加入50%甲醇6 mL、0.3%SDS溶液2 mL、1%鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液1 mL，暗處?kù)o置5 min，用0.1 mol·L-1HCl溶液定容，再暗處?kù)o置20 min，吸取50 μL測(cè)定溶液在292 nm處吸光度。以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、原兒茶酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得原兒茶酸線性回歸方程為：y=8.5188x+2.1548(R2=0.9999)，線性范圍10.8～54.0 μg·mL-1。

2.3.2 精密度

精密量取原兒茶酸對(duì)照溶液50 μL，連續(xù)檢測(cè)6次。計(jì)算RSD(n=6)為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性

精密稱取同一供試品6份，按1.5方法制備供試溶液，精密吸取50 μL檢測(cè)。計(jì)算RSD為1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性

精密量取供試溶液50 μL，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測(cè)。計(jì)算RSD為1.32%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.5 加標(biāo)回收率

精密稱取供試品35 mg，按1.5方法平行制備6份供試溶液，精密加入6.657 mg原兒茶酸對(duì)照品，制成樣品溶液。精密量取各樣品溶液50 μL檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 原兒茶酸的加標(biāo)回收率(n=6)

從表3可知，原兒茶酸的平均加標(biāo)回收率為101.1%，RSD為1.07%。

2.3.6 含量測(cè)定

根據(jù)方法學(xué)考察,原兒茶酸在10.8～54.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，測(cè)得白花九里明提取物中總有機(jī)酸含量為190.92 mg·g-1。

2.4 討論

采用HPLC法測(cè)定白花九里明提取物中的原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸的含量。對(duì)甲醇-0.1%磷酸(20∶80)、甲醇-水(20∶80)、乙腈-水(8∶92)和乙腈-0.1%磷酸(8∶92)等4種流動(dòng)相進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸(8∶92)為流動(dòng)相時(shí)，白花九里明提取物的色譜峰分離度較好，無拖尾現(xiàn)象。

酶標(biāo)法具有樣品和試劑用量少、速度快、效率較紫外可見分光光度法高等特點(diǎn)。因此，采用酶標(biāo)法測(cè)定白花九里明提取物中總黃酮和總有機(jī)酸的含量，其中，總黃酮含量測(cè)定采用三氯化鋁顯色法，總有機(jī)酸含量測(cè)定采用鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法。結(jié)果表明，三氯化鋁顯色法和鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色法適用于白花九里明提取物中總黃酮和總有機(jī)酸的含量測(cè)定,具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

建立了白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、總黃酮和總有機(jī)酸含量的測(cè)定方法。采用雙波長(zhǎng)切換高效液相色譜法測(cè)定原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸的含量，原兒茶酸在0.348～3.132 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為98.07%，RSD為1.35%；綠原酸在0.4～3.6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為97.49%，RSD 為 1.42%；咖啡酸在0.142～1.278 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為99.81%，RSD為0.43%。白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的含量分別為1.29 mg·g-1、3.68 mg·g-1、0.81 mg·g-1。采用酶標(biāo)法測(cè)定總黃酮和總有機(jī)酸的含量，發(fā)現(xiàn)槲皮素在8.24～41.20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9998)，平均加標(biāo)回收率為102.4%，RSD為0.75%；原兒茶酸在10.8～54.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)，平均加標(biāo)回收率為101.1%，RSD為1.07%。白花九里明提取物中總黃酮和總有機(jī)酸含量分別為22.33 mg·g-1和190.92 mg·g-1。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為白花九里明提取物中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、總黃酮和總有機(jī)酸的含量測(cè)定方法。