艱難梭菌耐藥性及其機(jī)制研究進(jìn)展

劉霽萱，李詠梅

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013)

艱難梭菌(Clostridium difficile)是一種革蘭陽(yáng)性厭氧菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，常見(jiàn)于動(dòng)物和人體腸道中，艱難梭菌屬于人體腸道的正常菌群。艱難梭菌感染(CDI)是由產(chǎn)毒株艱難梭菌過(guò)度繁殖導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)并釋放毒素引起的，被認(rèn)為是干擾糞便微生物群的直接結(jié)果，導(dǎo)致艱難梭菌和毒素表達(dá)的過(guò)度生長(zhǎng)。這與抗生素的使用密切相關(guān)。但是，其他幾種危險(xiǎn)因素也與CDI的發(fā)展有關(guān)，包括胃酸抑制，高齡，醫(yī)院暴露以及細(xì)胞或體液免疫功能低下[1]。主要臨床癥狀為發(fā)熱、腹痛、水樣便腹瀉[2]。

自2002年起發(fā)達(dá)國(guó)家如歐洲、美國(guó)等地區(qū)多次爆發(fā)艱難梭菌感染，患者發(fā)病率和死亡率迅速增加。近年來(lái)，由于廣譜抗生素的大量使用，艱難梭菌的抗藥性也逐漸增加，這不僅加重了患者的痛苦，同時(shí)也加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。本文就近年來(lái)艱難梭菌耐藥性及耐藥機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1 艱難梭菌致病機(jī)制

1.1 毒力因子

艱難梭菌致病的毒力因子分為毒素性和非毒素性。其中具有毒素性的毒力因子分別為TcdA、TcdB和CDT。TcdA、TcdB均為葡糖基轉(zhuǎn)移酶，可以滅活宿主細(xì)胞的GTP酶，破壞細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[4]。除TcdA和TcdB外，一些艱難梭菌分離株，特別是027和078核糖型菌株，還產(chǎn)生二元毒素，也稱為艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶(CDT),二元毒素可對(duì)宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白進(jìn)行修飾進(jìn)而破壞細(xì)胞骨架。瑞典的一項(xiàng)回顧性研究得出的結(jié)論是，與不分核糖型并且不產(chǎn)生CDT的菌株感染相比，感染CDT的艱難梭菌菌株的人死亡率更高。非毒素性的毒力因子在其致病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用，目前對(duì)其研究涉及到艱難梭菌黏附、定植、免疫逃避、孢子產(chǎn)生有關(guān)的一些毒力因子，如纖維素結(jié)合蛋白等[5]。它的研究對(duì)認(rèn)清艱難梭菌的致病機(jī)制及有關(guān)疫苗的研發(fā)具有潛在價(jià)值。

1.2 毒力相關(guān)基因

艱難梭菌毒力菌株的基因組均有一個(gè)19.6kb的致病決定區(qū)(pathogenicitylocus，PaLoc)，TcdA和TcdB基因均位于致病區(qū)域內(nèi)。除了TcdA和TcdB,PaLoc還編碼了另外3個(gè)名為TcdR、TcdE和TcdC的基因。TcdA和TcdB在TcdR、TcdC以及TcdE等基因調(diào)控下分泌TcdA和TcdB蛋白。TcdA、TcdB以及 TcdR在細(xì)菌靜止期轉(zhuǎn)錄，而TcdC轉(zhuǎn)錄發(fā)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，TcdR可能對(duì)TcdA、TcdB表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)作用，而TcdC可能發(fā)揮抑制作用[6,7]。目前關(guān)于tcdE的調(diào)控作用尚存在爭(zhēng)議，李先平等[8]的研究表明，tcdE與tcdA和tcdB的轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)，提示tcdE對(duì)tcdA、tcdB發(fā)揮正調(diào)控功能。

2 艱難梭菌對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥機(jī)制

2.1 甲硝唑

甲硝唑是一種硝基芳香藥物，它是治療輕度至中度艱難梭菌感染的首選抗菌藥物，大多數(shù)臨床艱難梭狀芽孢桿菌分離株在體外仍對(duì)甲硝唑高度敏感。2008年研究發(fā)現(xiàn)有12%的臨床分離株對(duì)甲硝唑表現(xiàn)出異質(zhì)耐藥性并且是可誘導(dǎo)的，而不是由于nim基因的存在[9]。2015年一項(xiàng)研究報(bào)告了在以色列傳播的對(duì)甲硝唑敏感性較低的菌株RT027，它們?cè)谝陨性斐蓢?yán)重感染，并于2013年在耶路撒冷廣泛暴發(fā)[10]。這種耐藥性是一個(gè)多因素過(guò)程，涉及不同代謝途徑的改變。此外，最近在體外獲得的證據(jù)似乎表明亞抑制濃度的甲硝唑能夠增強(qiáng)RT010菌株的生物膜產(chǎn)量，該菌株對(duì)這種抗生素敏感或易感性降低，表明生物膜可能在艱難梭菌對(duì)甲硝唑的耐藥性中發(fā)揮作用[11]。盡管對(duì)甲硝唑敏感性降低的機(jī)制未完全了解，但我認(rèn)為，研究甲硝唑敏感性降低對(duì)復(fù)發(fā)性CDI的病理生理學(xué)有潛在的影響。

2.2 萬(wàn)古霉素

萬(wàn)古霉素，是用于中度至重度CDI的一線抗生素,由糖基化的六肽鏈和芳基醚鍵交聯(lián)的芳香環(huán)組成，在胃腸道中吸收較差。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成部分，其作用機(jī)制可抑制肽聚糖的生物合成。在腸球菌和葡萄球菌中經(jīng)常觀察到對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥性，但在艱難梭菌中則沒(méi)有如此廣泛的傳播，耐藥機(jī)制仍不清楚。但在艱難梭菌中發(fā)現(xiàn)了幾種類似于Tn 1549的元素[12]，與糞腸球菌中描述的原始Tn 1549元素不同，艱難梭菌的Tn 1549樣元素不具有功能性van B操縱子。Ammam F等[13]發(fā)現(xiàn)在許多艱難梭菌分離物中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)的類似van g的基因簇，盡管該簇基因表達(dá)了，但它不能促進(jìn)對(duì)VAN的抗性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物膜中的艱難梭菌對(duì)高濃度的VAN(20 mg/l)具有更高的抵抗力，并且似乎在存在亞抑制濃度和抑制濃度的抗生素的情況下誘導(dǎo)了生物膜的形成[14]。

2.3 利福霉素和非達(dá)索霉素

利福霉素(Rifamycin,RIF)，特別是利福昔明(RFX)，最近已被視為治療復(fù)發(fā)性CDI的“追趕者療法”。非達(dá)索霉素(FDX)是一種新型殺菌的窄譜大環(huán)抗生素，用于治療具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的CDI。RIF和FDX都是細(xì)菌轉(zhuǎn)錄的抑制劑，但它們具有不同的RNA聚合酶(RNAP)靶位點(diǎn)。FDX與RNAP的“開(kāi)關(guān)區(qū)域”結(jié)合，RNAP是與RIF靶標(biāo)相鄰但不重疊的靶標(biāo)位點(diǎn)[15]。艱難梭菌中的利福霉素類易感性可以通過(guò)測(cè)試對(duì)RIF(一種與RFX相關(guān)的利福霉素)的易感性來(lái)評(píng)估。最近的研究數(shù)據(jù)表明，11%的艱難梭菌臨床分離株對(duì)RIF有耐藥性，總體耐藥率似乎正在上升[16]。

2.4 氟喹諾酮類

氟喹諾酮類藥物屬于廣譜抗生素，與CDI密切相關(guān)。菌株027的普遍流行可能與對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性有關(guān)。在美國(guó)和德國(guó)，莫西沙星的耐藥率約為36%和68%，加拿大莫西沙星的耐藥率可高達(dá)83%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在巴西和以色列，莫西沙星的耐藥率分別為8%和4.76%。新西蘭，瑞典，中國(guó)和法國(guó)，對(duì)艱難梭菌的氟喹諾酮耐藥率在7%至40%之間[17]。細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要分為：(1)編碼基因突變導(dǎo)致藥物靶點(diǎn)改變，導(dǎo)致對(duì)藥物的親和力降低(2)藥物的主動(dòng)流出增加或通透性降低。Oh H.,Edlund C.[18]研究表明，艱難梭菌對(duì)喹諾酮的耐藥性是由于DNA促旋酶亞基GyrA和(或)GyrB的變化所致,這些突變可以在喹諾酮耐藥性決定區(qū)域(QRDR)中發(fā)現(xiàn),T82I是GyrA中最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。D71V，T82V，D81N，A83V，A118V和A118T是GyrB中最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。

2.5 紅霉素和克林霉素

對(duì)于這一類藥物目前各國(guó)報(bào)道的耐藥率均較高，Tickler I.A.等[19]研究報(bào)告稱，美國(guó)30多家醫(yī)院發(fā)現(xiàn)艱難梭菌對(duì)克林霉素的耐藥率在36%左右。西班牙、波蘭和新西蘭對(duì)克林霉素的耐藥率約為74%、65%和61%。在中國(guó)、日本、韓國(guó)和伊朗克林霉素的耐藥率約為73.5%、87.7%、81%和89.3%[17]。這類藥物作用于細(xì)菌核糖體50S亞基，并通過(guò)抑制肽鏈的延伸，從而對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成進(jìn)行干擾。臨床病原體主要通過(guò)核糖體靶標(biāo)變化或主動(dòng)外排而對(duì)紅霉素和克林霉素具有耐藥性，而酶的失活也可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。而且erm基因陰性的艱難梭菌還可以表現(xiàn)出高水平的紅霉素耐藥性，但是機(jī)制尚不清楚[20]。

2.6 四環(huán)素

四環(huán)素(TET)是一種快速抑菌劑，耐藥性在各國(guó)之間有所不同，從2.4%到41.67%[21]，四環(huán)素可與細(xì)菌核糖體30S亞基的軸突起始部分特異性結(jié)合，從而防止氨酰基-tRNA與核糖體結(jié)合，抑制肽鏈延長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成。四環(huán)素的耐藥機(jī)制主要與四環(huán)素抗性蛋白(tetM)和主動(dòng)外排系統(tǒng)(tet A，B，C，D等)有關(guān)[22]。艱難梭菌主要通過(guò)核糖體保護(hù)蛋白(tetM)從而對(duì)四環(huán)素耐藥。

3 結(jié)語(yǔ)

艱難梭菌的耐藥性在世界范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)，近年來(lái)艱難梭菌感染已成為全球性問(wèn)題。由于對(duì)治療藥物的耐藥性逐漸增加，使用這些抗生素的局限性引起了極大的關(guān)注，同時(shí)需要進(jìn)一步研究以了解艱難梭菌的耐藥機(jī)制，這將為預(yù)防以及治療CDI提供新的目標(biāo)和新的思路。此外，在臨床上需要更多地關(guān)注艱難梭菌的耐藥性，以免盲目使用廣譜抗菌藥物，需盡量減少艱難梭菌感染的傳播和發(fā)生次數(shù)。