ApoE基因敲除構(gòu)建大鼠缺血性腦卒中模型的實(shí)驗(yàn)研究

王 雄，鄔玉芹，陳 紅，張 武，何占平，陳澤谷，夏 鷹，余 丹，陳 晶

(?？谑腥嗣襻t(yī)院暨中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，海南 ?？?70208)

缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點(diǎn)，約占腦血管疾病總數(shù)的60%-80%，社會(huì)負(fù)擔(dān)重[1-5]。缺血性腦卒中的治療及神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)是基礎(chǔ)和臨床研究的重點(diǎn)。腦血管疾病尤其是急性缺血性腦血管疾病的病理生理研究，依賴能模擬臨床疾病、重復(fù)性好的動(dòng)物模型。因此，建立能模擬臨床疾病、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的動(dòng)物模型特別重要，以便深入探討缺血性腦卒中的腦損傷機(jī)制、神經(jīng)保護(hù)機(jī)制及治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

采用雄性APOE(-/-)基因剔除大鼠100只(購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心)，SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，年齡約6周齡且體重為0.18-0.22 kg，動(dòng)物攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來(lái)水，置于12/12 h光/暗周期環(huán)境下24℃安靜溫控動(dòng)物房籠中，相對(duì)濕度45%左右，每籠3-5只飼養(yǎng)，依據(jù)大鼠品系分為2組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選用健康的6周齡雄性ApoE基因敲除大鼠100只，SPF級(jí)SD雄性大鼠100只，依據(jù)大鼠種類分為兩組。用線栓法堵塞大腦中動(dòng)脈2 h，缺血后2 h向外拔出線栓約2 mm再灌注22 h后行Zea-Longa評(píng)分，評(píng)分在2-3分為成功模型。統(tǒng)計(jì)不同種類大鼠成模成功率情況；在模型構(gòu)建3 d、7 d時(shí)行神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評(píng)分(NSS)和橫木行走實(shí)驗(yàn)(BWT)評(píng)分評(píng)估模型的穩(wěn)定性，同時(shí)行核磁共振(MRI)檢查了解各處理梗塞病灶范圍及變化。

1.3 磁共振成像(T1T2DWIPWI)

數(shù)據(jù)采集使用美國(guó)GE公司signa HDX 3.0 T MR機(jī)掃描,上海辰光醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的專用相控陣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物線圈(大鼠，5 cm孔徑)對(duì)大鼠行顱腦MR掃描。掃描時(shí)期：大鼠于缺血再灌注后24 h、72 h和7天之后行MR掃描。掃描前利用電子天平對(duì)大鼠稱重，腹腔注射4%水合氯醛10 mL/kg麻醉大鼠，約5 min大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)，由于掃描時(shí)間較長(zhǎng)，在掃描過(guò)程中大鼠出現(xiàn)清醒跡象適當(dāng)追加經(jīng)腹注射4%的水合氯醛水溶液。將麻醉好的大鼠取仰臥位，大鼠頭部、腹部分別施加膠帶固定于專用相控實(shí)驗(yàn)動(dòng)物線圈上，以視交叉為中心冠狀位定位掃描。掃描序列包括：①軸位T2加權(quán)序列：FOV60 mm×60 mm×20 mm，體素大小0.288 mm×0.288 mm，層厚1.2 mm，層間距0 mm，TSE 因子13，TR3150 ms，TEl00 ms，平均次數(shù)6，翻轉(zhuǎn)角90°。②軸位T1加權(quán)序列：FOV60 mm×60 mm×20 mm，體素大小0.268 mm×0.268 mm，層厚1.2 mm，層間距0 mm，15層，TR 340 ms，TE12 ms，平均次數(shù)4，翻轉(zhuǎn)角30°。③矢狀位T2加權(quán)序列。④軸位DWI序列：b值選擇1000 s/mm2。⑤PWI序列。缺血24 h后動(dòng)態(tài)觀察腦組織影像的變化情況及左右大腦半球的對(duì)稱情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同類別大鼠缺血性腦卒中動(dòng)物模型構(gòu)建成功率

通過(guò)激光多普勒腦血流儀測(cè)量大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后的局部腦血流變化。監(jiān)測(cè)大腦中動(dòng)脈線栓阻斷血流程度，證實(shí)模型的成功與否。大腦中動(dòng)脈血流有阻斷現(xiàn)象為建模成功，大腦中動(dòng)脈血流無(wú)阻斷現(xiàn)象及腦出血為建模失?。粺o(wú)腦出血大鼠均存活，腦出血者死亡。不同時(shí)間點(diǎn)兩種MCAO大鼠模型成功率比較：Apo-E基因缺陷大鼠組：缺血再灌注24 h符合Zea-Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)2-3分的鼠(成功鼠)82只，1分鼠10只，0分鼠3只，24 h內(nèi)死亡鼠5只，3日內(nèi)死亡鼠(包括成功鼠13只)共24只，7日內(nèi)死亡鼠(包括成功鼠14只)共25只。再灌注24 h內(nèi)模型成功率為82%，3日內(nèi)模型成功率為76%，缺血再灌注7日內(nèi)模型成功率為75%；SD大鼠組：缺血再灌注24 h符合Zea-Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)2-3分的鼠(成功鼠)87只，1分鼠7只，0分鼠3只，24 h內(nèi)死亡鼠3只，3日內(nèi)死亡鼠(包括成功鼠11只)共23只，7日內(nèi)死亡鼠(包括成功鼠14只)共27只。再灌注24 h內(nèi)模型成功率為87%，3日內(nèi)模型成功率為77%，缺血再灌注7日內(nèi)模型成功率為73%。不同時(shí)點(diǎn)基因缺陷組與SD組MCAO模型成功率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)，但不論Apo-E組還是WT組的建模成功率隨著時(shí)間的推移均存在一定程度的下降。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)兩種MCAO大鼠模型成功率比較

2.2 磁共振成像

將兩組缺血性腦卒中動(dòng)物模型均在缺血24 h、72 h和168 h時(shí)行MRI掃描，均行MRI-DWI、T2WI、PWI掃描，動(dòng)態(tài)觀察不同MR掃描序列不同掃描時(shí)間的影像表現(xiàn)情況。在MR-DWI及T2WI圖像上均能看到缺血側(cè)與對(duì)側(cè)(非缺血側(cè))影像存在明顯差異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在缺血1天、3天和7天缺血腦容積百分比比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；將MRI-PWI圖像與DWI圖像進(jìn)行融合后再利用圖像處理軟件(Image-Pro Plus6.0)測(cè)量和計(jì)算缺血核心區(qū)域、缺血半暗帶及總?cè)毖獏^(qū)域的百分比(%)。PWI與DWI融合后處理圖像顯示缺血核心區(qū)域隨著時(shí)間的推移缺血范圍先有所增大然后縮小，缺血半暗帶范圍逐漸擴(kuò)大，缺血核心、缺血半暗帶及總腦血流量的百分比隨著時(shí)間推移均有所降低(圖1)。將兩種缺血?jiǎng)游锬Ｐ腿毖?天和缺血3天的腦缺血容積百分比進(jìn)行比較(圖2、3)，在缺血第3天時(shí)兩種模型缺血半暗帶百分比間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而總?cè)毖莘e及缺血核心在缺血1天和3天均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。兩種腦缺血模型總體MR影像變化特點(diǎn)一致，但SD組較Apo-E基因缺陷組變化明顯。

圖1 MRI灌注圖像與DWI融合后處理圖像。紅色區(qū)域?yàn)槿毖诵膮^(qū)域，藍(lán)色則為缺血半暗帶。

圖2 兩種缺血性腦卒中動(dòng)物模型缺血1天腦容積百分比圖情況

圖3 兩種缺血性腦卒中動(dòng)物模型缺血3天腦容積百分比圖情況

2.4 MCAO鼠腦部大體表現(xiàn)TTC染色結(jié)果

成功模型腦標(biāo)本行TTC染色后大多表現(xiàn)為左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)染成蒼白色。部分死亡大鼠(死后立即TTC染色)可見整個(gè)左側(cè)半球蒼白、腫脹，提示整個(gè)頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)的缺血。

3 討論

3.1 缺血性腦卒中動(dòng)物模型成功率及穩(wěn)定性評(píng)估

評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建成功率和穩(wěn)定性評(píng)估是構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的重要組成部分，針對(duì)不同的要求其評(píng)估方法也不完全相同。目前腦卒中模型構(gòu)建成功率及穩(wěn)定性的評(píng)估方法主要有：激光多普勒血流測(cè)定、腦神經(jīng)功能評(píng)分、功能磁共振檢查、TTC染色實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色和蛋白印跡法等。不同評(píng)估方法在評(píng)估中所起的作用也存在很大的差異。激光多普勒主要應(yīng)用于觀察和檢測(cè)整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)的血液灌注量、血細(xì)胞數(shù)和移動(dòng)速度等血流指標(biāo)分析，可直接觀察大腦中動(dòng)脈栓塞模型的栓塞情況。神經(jīng)功能評(píng)分主要是通過(guò)動(dòng)物的行為學(xué)改變間接評(píng)估線栓對(duì)動(dòng)物模型的神經(jīng)功能的影響情況。隨著功能磁共振的飛速發(fā)展，MRI已成為缺血性腦卒中的重要診斷手段。大量研究表明MR-DWI及PWI成像能夠清晰顯示腦缺血的部位及范圍[6,7]，特別是能夠進(jìn)行活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和觀察腦缺血的范圍變化情況。TTC染色能夠很好的確定模型的生物行為學(xué)改變是由組織缺血所致。免疫熒光和蛋白分子印跡能夠從分子角度評(píng)估動(dòng)物模型的神經(jīng)功能狀況。本研究采用多種方法對(duì)構(gòu)建的缺血性腦卒中動(dòng)物模型的穩(wěn)定行穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，取長(zhǎng)補(bǔ)短，從行為學(xué)、影像學(xué)和分子免疫學(xué)等多方位全面評(píng)估該模型的穩(wěn)定性，旨在充分肯定其建模效果。

3.2 建模動(dòng)物的選擇

多種脂蛋白中都存在ApoE，ApoE的主要作用是參與脂質(zhì)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、利用和排泄，在血漿膽固醇的調(diào)節(jié)過(guò)程中也發(fā)揮著十分重要的作用。ApoE是動(dòng)脈粥樣硬化和高血脂等病變發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的分子靶標(biāo)。將ApoE基因敲除后可導(dǎo)致富含膽固醇的脂蛋白清除受到障礙，從而使血漿中膽固醇水平明顯增高致使大量脂蛋白在機(jī)體內(nèi)蓄積而形成斑塊。有研究表明ApoE基因敲除大鼠可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化，予以普通飼料喂養(yǎng)至15周齡即可出現(xiàn)典型斑塊特征的復(fù)雜病變，這與老年患者血管多發(fā)斑塊的表現(xiàn)及病變過(guò)程非常相似，采用ApoE基因敲除大鼠制備動(dòng)物模型能夠更好的模擬人體內(nèi)病變的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸情況，目前已成為探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及研究干預(yù)手段的極佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化病變局部動(dòng)脈內(nèi)膜常出現(xiàn)病理性的血管新生，新生血管可促進(jìn)粥樣硬化的發(fā)展，甚至誘發(fā)斑塊出血和斑塊，而這過(guò)程與VEGF調(diào)節(jié)血管新生有重要關(guān)聯(lián)性。VEGF具有特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂、遷移、促進(jìn)新生血管形成的作用，其過(guò)程主要是通過(guò)2個(gè)在血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表達(dá)受體來(lái)完成的VEGFR-1和VEGFR-2生物學(xué)功能[8-10]。VEGFR-1主要表達(dá)在造盤干細(xì)胞上。而VEGFR-2 則主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上。因此，VEGF所引起的內(nèi)皮細(xì)胞生理或病理的改變主要是由VEGF 或VEGFR-2通路所介導(dǎo)。

由此可見Apo-E基因缺失可制備穩(wěn)定、成功率高的MCAO大鼠模型，操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、重復(fù)性好，為進(jìn)一步研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制及評(píng)估療效提供良好的依據(jù)。