AFP、GP73及miR-221 聯(lián)合檢測對于原發(fā)性肝細胞癌的診斷價值

于艷華，王 穎，代芳芳，黃曉婕，婁金麗*

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 1.臨床檢驗中心；2.臨床感染中心，北京100069)

原發(fā)性肝細胞癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，由于很多原發(fā)性肝細胞癌患者診斷時已經(jīng)處于晚期導致患者的預后普遍較差。因此，早期發(fā)現(xiàn)治療是良好療效的關(guān)鍵[1]。多數(shù)原發(fā)性肝細胞癌早期無癥狀,使得早期診斷變得困難。分子生物技術(shù)的發(fā)展確定了許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物標志物。甲胎蛋白(AFP)是臨床應用中最常用的血清學生物標志物，但由于敏感性和特異性較低，臨床診斷AFP的準確性不理想，迫切需要更具特異性生物標志物[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)了其他可能用于早期檢測原發(fā)性肝細胞癌的生物標志物，包括高爾基體蛋白-73(GP73)、microRNA(miR)等等。然而，血清標志物單獨檢測原發(fā)性肝細胞癌的敏感性和特異性較低[3]。在本研究中，我們探討了聯(lián)合AFP、GP73和miR-221檢測作為血清生物標志物來提高原發(fā)性肝細胞癌的診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2019年9月-2019年12月間確診的原發(fā)性肝細胞癌患者50例(肝癌組),男性患者36例，女性14例；中位年齡53歲；肝硬化組50例，男性39例，女性11例，中位年齡55歲。對照組50例患者中，男31例，女19例，中位年齡50歲。

1.2 樣本采集

外周血 3-4 ml在室溫下離心 1 300×g 20 min，抽取上層透明微黃的血漿 0.5 ml，加入等量的(0.5 ml)樣本保存液中，標本存于-80℃冰箱待測。

1.3 檢測方法

1.3.1GP73采用酶聯(lián)免疫法檢測，試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供。取出試劑盒和待測樣本，在室溫(18-28 ℃)平衡至少30 min。分別在相應孔中加入50 μl校準品(S0-S7)和血清樣本(空白孔不加)，充分振蕩混勻30 s。用封板膜封板后37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌6遍，每次每孔應加入至少300 μl洗滌液，最后一遍洗滌后在干凈吸水紙上扣干每孔加入100 μl酶結(jié)合物(空白孔不加)，振蕩混勻30 s。用封板膜封板后37 ℃溫育30 min。再次用洗板機洗滌6遍每孔加入單組份TMB顯色液100 μl，振蕩30 s，用封板膜封板后37 ℃避光溫育10 min。每孔加入50 μl終止液，振蕩混勻30 s，使用酶標儀在450 nm波長處測量各孔吸光度值(OD值)。酶標儀無需空白孔調(diào)零點。需在終止反應后10 min內(nèi)進行測定。GP73>3.65 ng/ml為陽性。

1.3.2RT-PCR分析miR-221的表達，試劑盒由駿實生物科技(上海)有限公司提供。Trizol 法提取血清中的RNA在擴增檢測區(qū)，使用混勻儀將 RP 板 1 200 rpm 混勻 15 秒，然后低速離心 15 s。放入熱循環(huán)儀，按照以下循環(huán)參數(shù)進行反轉(zhuǎn)錄反應。在放入熱循環(huán)儀前，始終保持反轉(zhuǎn)錄反應液和 RP 板在 2-8℃。在擴增檢測區(qū)，吸移 75 μl的稀釋緩沖液到每個 RP 板反應孔內(nèi)，稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用移液器輕輕吹打 10 次使徹底混勻，注意避免氣泡。在 PCR 板(PP)的相應反應孔里加入 9 μl稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。加樣完畢后，用封板膜密封 PCR 板(PP)，在混勻儀上以 1 200 rpm 混勻15 s，然后低速離心15 s。放入 PCR 熱循環(huán)儀，啟動程序。miR-221相對值>3.0為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 AFP、GP73及miR-221比較

原發(fā)性肝細胞癌組患者血清 AFP(陽性參考值：>10 ng/ml、GP73及miR-221水平明顯高于肝硬化組和正常對照組，并且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，肝硬化組患者血清 AFP、GP73及miR-221水平與正常對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 3種血清標志物在不同人群檢測結(jié)果的比較

2.2 AFP、GP73及miR-221單獨與聯(lián)合陽性率比較

原發(fā)性肝細胞癌患者血清AFP、GP73及miR-221陽性率分別66%、64%、68%，聯(lián)合檢測陽性率86%，明顯高于單項指標檢測，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 血清學指標單獨檢測和聯(lián)合檢測的陽性率比較(例，%)

2.3 AFP、GP73及miR-221單獨與聯(lián)合特異性以及敏感性比較

血清AFP、GP73及miR-221聯(lián)合檢測敏感性為 86.0%，明顯高于各個血清標記物單一檢測，并且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；但在特異性方面，3種血清標志物聯(lián)合檢測特異性為69%，低于AFP、GP73及miR-221 單項檢測，但沒有統(tǒng)計學差異，見表3。

表3 三種標志物單獨檢測和聯(lián)合檢測肝癌特異性及敏感性比較(%)

3 討論

原發(fā)性肝細胞癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療對改善患者預后有重要影響。然而，相當多的肝癌患者在晚期才被確診，而此時治療方案也是有限的。臨床表現(xiàn)、影像、血清標記物等方法是臨床診斷的重要依據(jù)。但是，目前臨床常用的血清標記物AFP的敏感性和特異性不強[4]。作為肝癌的常規(guī)標志物，AFP在腫瘤小于3 cm時常常檢測不到或表達水平較低。此外，肝炎肝硬化和慢性肝炎患者中也可以看到AFP水平的升高。因此，迫切需要尋找檢測能力更好的新的生物標志物[5]。理想情況下，原發(fā)性肝細胞癌的生物標志物應該是高度敏感的肝細胞癌與其他類型的肝臟病變有區(qū)別，在早期高水平表達。在我們的研究中，血清AFP、GP73及miR-221聯(lián)合使用大大提高了原發(fā)性肝細胞癌的檢測能力。本研究證明，血清AFP、GP73 和miR-221聯(lián)合檢測作為診斷原發(fā)性肝細胞癌的生物標志物具有優(yōu)越性。

GP73又稱高爾基體磷酸化蛋白2(GOLPH2)，是高爾基體跨膜蛋白，含400個氨基酸、分子量73kDa的糖蛋白。最近的一些研究表明GP73是最有希望的原發(fā)性肝細胞癌血清標志物之一。盡管有研究報道GP73在早期原發(fā)性肝細胞癌診斷中的敏感性高于AFP(62%比25%)[6]。但GP73是否優(yōu)于AFP仍存在爭議，有研究表明,GP73是肝癌有價值的生物標志物,并且在敏感性和特異性上優(yōu)于AFP[7]。他們還發(fā)現(xiàn)GP73和AFP聯(lián)合檢測可以進一步提高敏感性。另一項meta分析發(fā)現(xiàn)[8]，GP73作為原發(fā)性肝細胞癌的獨立診斷標志物，與AFP具有可比性。在我們的研究中，結(jié)果顯示GP73作為獨立的標志物與AFP陽性率及敏感性相似。

microRNA 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA。研究表明 microRNA 參與多種人體調(diào)節(jié)，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。人的血漿中存在大量穩(wěn)定的 microRNA，并且大量研究揭示microRNA 與肝癌發(fā)病和預后等具有一定的相關(guān)性。與肝硬化、肝炎患者及健康人相比，肝癌患者血漿中的 miR-122、miR-21和miR-223 水平具有顯著的差異[9]，miR-221 是近年來發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肝細胞癌患者血清中會出現(xiàn)明顯上調(diào)的一類microRNA，提示其可能與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生有相關(guān)性[10]。其他研究者的結(jié)果表明患者血清中 miR-221表達的改變與肝癌患者的生存率具有相關(guān)性[11]。這也是我們選擇 miR-221研究的原因。本研究顯示，AFP、GP73及miR-221 在原發(fā)性肝細胞癌患者血清中的陽性率分別為66%、64%、74%，而聯(lián)合檢測提升陽性率達86%，敏感性明顯較單項檢測高。

綜上所述，我們的研究表明，聯(lián)合AFP、GP73及miR-221作為血清標記物可以顯著提高原發(fā)性肝細胞癌的檢測能力，并且比單獨使用任何一個都具有更高的靈敏度，可能成為目前診斷原發(fā)性肝細胞癌的一個有價值的補充。對于原發(fā)性肝細胞癌的臨床診斷具有非常重要的意義。