姜黃素通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎性體軸調(diào)控大鼠急性胰腺炎的研究

徐 娟，陳卓鋒，王治偉

0 引言

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的一種胰腺組織炎癥反應(yīng)性疾病，由胰蛋白酶原異?；罨餥1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率。近年來(lái)，AP的發(fā)病率逐年增加[2]，大約有20%的患者會(huì)發(fā)展為重癥急性胰腺炎(SAP)，甚至有一些患者由于其引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征和多種器官衰竭而死亡[3-4]。AP早期典型的特征是消化酶誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞局部壞死，然后觸發(fā)促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等的產(chǎn)生[5]，并促使這些炎性因子募集到炎癥發(fā)生部位，從而加劇了胰腺損傷以及病情的惡化等[6-7]。盡管近幾十年對(duì)AP進(jìn)行了大量的研究，但是引起胰腺炎性反應(yīng)的病理生理機(jī)制仍未被完全闡明，并且尚未開發(fā)出有效的治療藥物和方法。

核因子-κB(NF-κB)是一種核促炎轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，而這些基因表達(dá)對(duì)于炎癥信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用[8]。NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體介導(dǎo)了機(jī)體對(duì)微生物感染和細(xì)胞損傷的免疫應(yīng)答，是多種疾病病理生理機(jī)制的重要組成部分[9]。在AP的研究中，NF-κB和炎癥介質(zhì)的作用不斷受到重視。研究表明，NF-κB與NLRP3炎性小體參與AP的發(fā)生，抑制NF-κB通路與NLRP3炎性小體激活可減輕胰腺和其他器官的損傷[10-12]。

姜黃素(Curcumin)是一種來(lái)源于姜黃根莖且具有活性的多酚物質(zhì)，已有研究證明，姜黃素不僅具有抗炎、抗氧化與抗腫瘤作用[13]，還能夠通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有效阻止腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。因此，本研究旨在探討姜黃素對(duì)牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)的AP大鼠的保護(hù)作用，以及對(duì)NF-κB通路與NLRP3炎性體軸的作用機(jī)制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 主要試劑：姜黃素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，2%戊巴比妥鈉購(gòu)自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，5%牛磺膽酸鈉購(gòu)自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司，血清淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，蘇木素、伊紅染液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；山羊血清、5%脫脂牛奶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；抗NLRP3、NF-κB、caspase-1、ASC、p65、IκBα、p-p65以及鼠抗β-actin、抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG等抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒與TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

動(dòng)物：84只健康SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，6～8周齡，體重180～220 g，購(gòu)自廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(粵)2018-0013。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組、造模及給藥 84只雄性Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)前在溫度為20～25 ℃、濕度為45%～55%、12 h明暗交替的飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水及攝食。參照文獻(xiàn)[15]制備AP模型。在造模前所有大鼠禁食12 h，然后隨機(jī)分為4組(每組21只)：模型組、假手術(shù)組、姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組。模型組通過(guò)腹膜內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉麻醉，將5%?；悄懰徕c溶液穿刺管逆行注射到膽胰管建立AP模型；假手術(shù)組大鼠用等量生理鹽水代替5%牛磺膽酸鈉溶液進(jìn)行注射，其他操作均與模型組相同；姜黃素低劑量組在注射?；悄懰徕c前1 h腹腔注射姜黃素50 mg/kg，然后在注射?；悄懰徕c后每天注射姜黃素(50 mg/kg)1次，持續(xù)3 d；姜黃素高劑量組在注射牛磺膽酸鈉前1 h腹腔注射姜黃素100 mg/kg，然后在注射?；悄懰徕c后每天注射姜黃素(100 mg/kg)1次，持續(xù)3 d。3 d后采集大鼠下腔靜脈血，采血完畢處死所有大鼠，解剖取大鼠胰腺組織，將一部分胰腺組織固定在4%多聚甲醛中，將另一部分置于液氮后儲(chǔ)存在-80 ℃下。

1.2.2 血清淀粉酶和脂肪酶活性測(cè)定 抽取血液自然凝固后，4 ℃下以2 000 r/min的速度離心10 min分離血清，通過(guò)比色法檢測(cè)血清淀粉酶和脂肪酶活性。①淀粉酶活性測(cè)定步驟：將底物緩沖液在37 ℃預(yù)溫5 min，加入稀釋的血清，混勻，37 ℃反應(yīng)7.5 min，加入碘應(yīng)用液，立即加水混勻，以蒸餾水調(diào)零，使用酶標(biāo)儀在660 nm處測(cè)定各管的吸光度(OD)值。②脂肪酶活性測(cè)定步驟：將底物緩沖液在37 ℃預(yù)溫6 min，依次加入待測(cè)血清、底物緩沖液，混合均勻，在酶標(biāo)儀420 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，接著在37 ℃反應(yīng)10 min，再次讀取吸光度值A(chǔ)2。

1.2.3 ELISA法 將收集的血液，室溫下孵育2 h后，4 ℃下以2 000 r/min的速度離心10 min分離血清，檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，具體操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值。

1.2.4 HE染色 將4%多聚甲醛溶液中固定好的胰腺組織取出，進(jìn)行脫水與石蠟包埋，切成5 μm切片。37 ℃干燥過(guò)夜，60 ℃處理20 min，將玻片浸入二甲苯中泡片10 min，使用由高到低的梯度酒精(100%，90%，80%和70%)浸泡，每次2 min，在流水下沖洗。然后使用蘇木精染色5 min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3 min，由低到高的梯度酒精(70%，80%，90%和100%)依次脫水，二甲苯浸泡5 min，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片脫蠟至水，PBS溶液中浸泡5 min，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，4%過(guò)氧化氫清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，加山羊血清液室溫孵育30 min，然后分別滴加兔抗NLRP3(1∶200)與兔抗NF-κB(1∶200)作為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS沖洗，滴加二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片，在電子顯微鏡下進(jìn)行圖像采集與分析。若胞漿呈黃色細(xì)顆粒狀則判斷為陽(yáng)性產(chǎn)物。

1.2.6 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液提取各組大鼠胰腺組織總蛋白，BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30 μg各組蛋白樣本進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后分別加兔抗NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)以及鼠抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌，采用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影后，使用Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰腺組織病理性形態(tài)學(xué)觀察 HE染色結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰正常，未出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血的現(xiàn)象；模型組胰腺組織局部壞死、出血以及水腫，腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間隔明顯變寬；姜黃素低劑量組胰腺組織局部壞死、出血及水腫減輕，腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，而炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；姜黃素高劑量組胰腺組織局部壞死、出血及水腫顯著改善，偶見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整。

圖1 HE染色檢測(cè)各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)變化

2.2 各組大鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量比較 各組大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶測(cè)定結(jié)果如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清淀粉酶含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組大鼠血清淀粉酶含量降低，且具有劑量依賴性(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清脂肪酶含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組大鼠血清脂肪酶含量呈劑量依賴性地降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 比色法測(cè)定各組大鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平比較 各組大鼠血清炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α檢測(cè)結(jié)果見表1，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高；與模型組比較，姜黃素低、高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 各組大鼠胰腺組織NLRP3、NF-κB通路蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 通過(guò)免疫組化染色觀察胰腺組織NLRP3、NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。與假手術(shù)組比較，模型組NLRP3、NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組NLRP3、NF-κB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均降低，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清炎性因子水平(pg/ml，n=21)

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠胰腺組織NLRP3、NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)

2.5 各組大鼠胰腺組織NLRP3、NF-κB通路蛋白表達(dá)水平比較 Western blot檢測(cè)各組大鼠胰腺組織中NLRP3炎性體和NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組IκBα蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，p-p65、p65蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素低劑量組和姜黃素高劑量組IκBα蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，而p-p65、p65蛋白表達(dá)降低，均具有劑量依賴性(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠胰腺組織NLRP3炎性小體和NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

AP的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，其臨床特點(diǎn)為上腹痛、惡心、嘔吐與發(fā)熱等。其病情發(fā)展迅速，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致多器官損傷從而引起死亡[16]。本研究通過(guò)逆行胰膽管穿刺法制備AP大鼠模型，檢測(cè)結(jié)果顯示，胰腺腺泡細(xì)胞大量壞死，出現(xiàn)大面積炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血清淀粉酶和脂肪酶含量增加，血清炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高，表明模型大鼠胰腺組織出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥性損傷和組織病理改變，提示大鼠AP模型制備成功。改善AP關(guān)鍵在于控制炎癥反應(yīng)，通過(guò)減少炎癥反應(yīng)來(lái)減輕胰腺損傷，進(jìn)而促進(jìn)腸道功能恢復(fù)并防治多器官功能并發(fā)癥[6]。

本研究顯示，姜黃素低劑量組與高劑量組大鼠胰腺組織損傷程度逐步減輕，血清淀粉酶和脂肪酶含量呈下降趨勢(shì)，IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低。說(shuō)明姜黃素可減輕AP模型大鼠胰腺組織損傷，改善胰腺炎時(shí)微循環(huán)的狀況。胰腺腺泡細(xì)胞中的淀粉酶和脂肪酶通常用作AP診斷的生化標(biāo)記，這些酶會(huì)使腺泡細(xì)胞發(fā)生損傷，促進(jìn)局部和全身性炎癥反應(yīng)[17]。同樣，各種炎性因子的過(guò)度釋放會(huì)導(dǎo)致腺泡細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，從而引發(fā)局部胰腺炎發(fā)展為全身性炎癥反應(yīng)[18]。TNF-α和IL-6為促發(fā)早期胰腺炎的重要誘因，在其刺激下，單核巨噬細(xì)胞會(huì)釋放更多的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，并上調(diào)黏附分子水平，從而介導(dǎo)組織損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞腫脹和死亡的發(fā)生[19]。本研究中，姜黃素處理阻止了血清淀粉酶和脂肪酶含量的增加，以及IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，這表明姜黃素可能會(huì)減少AP期間外分泌酶的過(guò)度分泌與炎性因子的產(chǎn)生。

NF-κB在多種炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，激活后會(huì)導(dǎo)致多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，NF-κB信號(hào)通路激活是AP發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵一步[20]。研究表明，抑制NF-κB可以延長(zhǎng)?；悄懰猁}誘導(dǎo)的胰腺炎大鼠的生存時(shí)間并減輕炎癥反應(yīng)，NF-κB持續(xù)升高可能導(dǎo)致慢性胰腺炎發(fā)生惡化[21]。本研究結(jié)果與先前的結(jié)果一致，AP大鼠胰腺組織中NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)增加，IκBα蛋白表達(dá)降低，p-p65、p65蛋白表達(dá)升高，而低劑量和高劑量姜黃素能使胰腺組織中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)水平逐步下降，IκBα蛋白表達(dá)升高，p-p65、p65蛋白表達(dá)降低。

NLRP3炎性小體是由無(wú)活性的caspase-1前體、NLRP和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)組成的復(fù)合體，能夠識(shí)別多種誘導(dǎo)炎癥的刺激并激活caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟以及其他一些重要促炎因子產(chǎn)生與釋放，最終使組織細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[22-23]。本研究中，AP大鼠胰腺組織中NLRP3的陽(yáng)性表達(dá)增加，NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)升高，而低、高劑量姜黃素均能使胰腺組織中NLRP3陽(yáng)性表達(dá)以及NLRP3、caspase-1、ASC蛋白水平下降。ASC作為NLRP3炎性小體的銜接蛋白，能夠把caspase-1前體與NLRP3連接起來(lái)，形成高濃度caspase-1前體并使自身活化，形成具有酶活性的caspase-1[24]。caspase-1作為炎性小體的效應(yīng)蛋白，可以將無(wú)活性的IL-18和IL-1β前體剪切為成熟且具有功能的IL-18和IL-1β[25]。

綜上所述，姜黃素可減輕AP大鼠的胰腺組織損傷，減少血清脂肪酶和淀粉酶含量并降低炎性因子的水平，抑制NF-κB通路與NLRP3炎性體軸激活，提示姜黃素對(duì)AP大鼠具有保護(hù)作用。