厄貝沙坦對(duì)腎缺血再灌注損傷小鼠細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

劉 華，馮 玉，楊 靜，張瑞城

0 引言

腎缺血再灌注損傷(Renal ischemic reperfusion injury，RIRI)是急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)的最主要原因，RIRI后氧自由基的富集，炎癥反應(yīng)的激活，都可以誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞損傷，出現(xiàn)AKI特征性的病變[1-2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在急慢性腎損傷發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[3]，厄貝沙坦是一種高選擇性血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)受體拮抗藥[4]，可以顯著擴(kuò)張腎小球出球小動(dòng)脈，降低腎小球內(nèi)壓，降低尿蛋白，對(duì)患者腎功能發(fā)揮保護(hù)作用[5]。本研究用夾閉小鼠腎動(dòng)脈的方法建立RIRI動(dòng)物模型，在此基礎(chǔ)上觀察厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 厄貝沙坦為法國賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：1822156)，血肌酐(Creatinine，Cr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)檢測(cè)試劑盒購自瑞士Roche公司，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司，腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(Interleukin，IL)-6、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，P65和Histone抗體購自美國Abcam公司。BX53MRF-S顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，Cobas Integra 800全自動(dòng)生化分析儀購自瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只清潔級(jí)健康雄性C57/BL小鼠購自海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(瓊)2017-0012]，6～8周齡，體重20～30 g，清潔級(jí)環(huán)境下自由進(jìn)水和食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。使用數(shù)字表法將60只小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、RIRI組、低劑量厄貝沙坦組(10 mg/kg，低劑量組)、高劑量厄貝沙坦組(20 mg/kg，高劑量組)，每組15只。

1.3 RIRI小鼠動(dòng)物模型的建立 所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，背部皮膚消毒，切開腰背筋膜，分離腎周圍組織，暴露雙側(cè)腎臟，無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)腎動(dòng)脈后發(fā)現(xiàn)腎臟組織變白，繼續(xù)阻斷45 min后松開無創(chuàng)動(dòng)脈夾，腎灌注良好后分層縫合切口，最后縫合皮膚，術(shù)后12 h斷頸處死所有小鼠，取心臟血液和腎臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。假手術(shù)組僅暴露腎臟，不阻斷腎動(dòng)脈，RIRI組、低劑量組、高劑量組進(jìn)行腎動(dòng)脈阻斷造模處理，低劑量組、高劑量組在造模前3 d給予10、20 mg/kg厄貝沙坦灌胃，1次/d。

1.4 Cr、BUN、SOD、MDA、TNF-α、IL-6的檢測(cè) 小鼠斷頸處死后快速提取小鼠心臟血液送檢驗(yàn)科，鄰苯三酚法測(cè)定SOD，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA，ELISA檢測(cè)Cr、BUN、TNF-α和IL-6，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，使用全自動(dòng)生化分析儀完成檢測(cè)。

1.5 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 小鼠斷頸處死后取出腎臟組織，4%福爾馬林溶液固定，送交病理科制作組織蠟塊，4 μm厚切片后，脫蠟以及梯度乙醇脫水，蛋白酶K[10 μg/ml，0.1-M Tris，50 mM EDTA(pH 8)]滲透消化組織，室溫15 min，末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)反應(yīng)緩沖液處理10 min，37 ℃加入TDT反應(yīng)混合物60 min，最后3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)顯色，蘇木精復(fù)染。棕褐色著色為凋亡陽性細(xì)胞，每高倍鏡(200×)下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptosis index，AI)，AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 Western blot檢測(cè) 小鼠斷頸處死后取出腎臟組織，取50 mg組織，液氮下研磨，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞制造單細(xì)胞懸液，置冰上水中裂解細(xì)胞膜30 min，10 000 g離心20 min，取沉淀物加入細(xì)胞核裂解液作用20 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉浸PVDF膜1 h，加入P65(1∶1 000)和Histone(1∶5 000)抗體，4 ℃孵育過夜后加入二抗，X-ray曝光顯色目的條帶，對(duì)照內(nèi)參Histone計(jì)算各組P65蛋白的相對(duì)灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠腎功能的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組Cr和BUN組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中低劑量組和高劑量組Cr和BUN顯著低于RIRI組(P<0.05和P<0.01)，高劑量組Cr和BUN顯著低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 四組小鼠Cr和BUN比較

2.2 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組MDA、SOD、TNF-α和IL-6組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中低劑量組和高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于RIRI組，SOD顯著高于RIRI組(P<0.05和P<0.01)，而高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于低劑量組，SOD顯著高于低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 四組小鼠SOD、MDA、TNF-α和IL-6比較

2.3 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組AI分別為0.34%±0.05%、32.14%±3.46%、22.32%±3.17%和14.06%±1.53%，四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.317，P<0.01)，其中低劑量組和高劑量組AI顯著低于RIRI組(P<0.01)，而高劑量組AI顯著低于低劑量組(P<0.01)。見圖1。

圖1 小鼠TUNEL細(xì)胞凋亡染色(200×)

2.4 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠NF-κB通路的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組細(xì)胞核P65蛋白的相對(duì)灰度值分別為0.06±0.01、0.52±0.09、0.27±0.04和0.16±0.03，四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.426，P<0.01)，其中低劑量組和高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于RIRI組(P<0.01)，而高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于低劑量組(P<0.01)。見圖2。

圖2 小鼠P65蛋白的Western blot檢測(cè)

3 討論

臨床上約47%的AKI是由RIRI引起。RAS紊亂是腎損傷的主要途徑之一[6]。RAS紊亂可通過Ang Ⅱ 1型受體的直接作用導(dǎo)致腎小管損傷，臨床上給糖尿病腎病患者早期使用AngⅡ受體抑制藥物厄貝沙坦，可以延緩腎功能的惡化[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量組和高劑量組Cr和BUN顯著低于RIRI組，而高劑量組Cr和BUN顯著低于低劑量組，說明厄貝沙坦可以拮抗RIRI的腎損傷，而且呈劑量依賴關(guān)系。

RIRI激發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究顯示，抗氧化抗炎可以保護(hù)RIRI腎損傷[8]。李貴榮等[9]研究顯示，下調(diào)血管緊張素Ⅱ可以抑制大鼠肝臟缺血再灌注損傷。Kabel等[10]研究顯示，厄貝沙坦可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的肝損傷，MDA、SOD、TNF-α和IL-6是常用的氧化應(yīng)激炎癥監(jiān)控指標(biāo)，本研究顯示，低劑量組和高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于RIRI組，SOD顯著高于RIRI組，而高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于低劑量組，SOD顯著高于低劑量組，表明厄貝沙坦可以抑制RIRI小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。NF-κB是體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路，通路激活后P65蛋白入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)氧化炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡[11]。研究顯示，抑制NF-κB通路可以保護(hù)RIRI腎功能[12]。本研究顯示，低劑量組和高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于RIRI組，高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于低劑量組，說明厄貝沙坦可以劑量依賴性地抑制RIRI小鼠NF-κB通路激活。細(xì)胞凋亡分析也顯示，低劑量組和高劑量組AI低于RIRI組，高劑量組AI低于低劑量組，說明厄貝沙坦可以劑量依賴性地抑制RIRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能是通過抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，厄貝沙坦可以抑制RIRI小鼠NF-κB通路激活，抑制氧化炎癥反應(yīng)，抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮RIRI損傷的腎臟保護(hù)作用。