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    厄貝沙坦對(duì)腎缺血再灌注損傷小鼠細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

    2020-08-28 08:40:02張瑞城
    實(shí)用藥物與臨床 2020年8期
    關(guān)鍵詞:貝沙坦腎小管低劑量

    劉 華,馮 玉,楊 靜,張瑞城

    0 引言

    腎缺血再灌注損傷(Renal ischemic reperfusion injury,RIRI)是急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)的最主要原因,RIRI后氧自由基的富集,炎癥反應(yīng)的激活,都可以誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞損傷,出現(xiàn)AKI特征性的病變[1-2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在急慢性腎損傷發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[3],厄貝沙坦是一種高選擇性血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)受體拮抗藥[4],可以顯著擴(kuò)張腎小球出球小動(dòng)脈,降低腎小球內(nèi)壓,降低尿蛋白,對(duì)患者腎功能發(fā)揮保護(hù)作用[5]。本研究用夾閉小鼠腎動(dòng)脈的方法建立RIRI動(dòng)物模型,在此基礎(chǔ)上觀察厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。

    1 材料和方法

    1.1 主要試劑 厄貝沙坦為法國賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào):1822156),血肌酐(Creatinine,Cr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)檢測(cè)試劑盒購自瑞士Roche公司,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司,腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(Interleukin,IL)-6、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司,P65和Histone抗體購自美國Abcam公司。BX53MRF-S顯微鏡購自日本奧林巴斯公司,Cobas Integra 800全自動(dòng)生化分析儀購自瑞士Roche公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只清潔級(jí)健康雄性C57/BL小鼠購自海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(瓊)2017-0012],6~8周齡,體重20~30 g,清潔級(jí)環(huán)境下自由進(jìn)水和食物,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。使用數(shù)字表法將60只小鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、RIRI組、低劑量厄貝沙坦組(10 mg/kg,低劑量組)、高劑量厄貝沙坦組(20 mg/kg,高劑量組),每組15只。

    1.3 RIRI小鼠動(dòng)物模型的建立 所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,背部皮膚消毒,切開腰背筋膜,分離腎周圍組織,暴露雙側(cè)腎臟,無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷雙側(cè)腎動(dòng)脈后發(fā)現(xiàn)腎臟組織變白,繼續(xù)阻斷45 min后松開無創(chuàng)動(dòng)脈夾,腎灌注良好后分層縫合切口,最后縫合皮膚,術(shù)后12 h斷頸處死所有小鼠,取心臟血液和腎臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。假手術(shù)組僅暴露腎臟,不阻斷腎動(dòng)脈,RIRI組、低劑量組、高劑量組進(jìn)行腎動(dòng)脈阻斷造模處理,低劑量組、高劑量組在造模前3 d給予10、20 mg/kg厄貝沙坦灌胃,1次/d。

    1.4 Cr、BUN、SOD、MDA、TNF-α、IL-6的檢測(cè) 小鼠斷頸處死后快速提取小鼠心臟血液送檢驗(yàn)科,鄰苯三酚法測(cè)定SOD,硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA,ELISA檢測(cè)Cr、BUN、TNF-α和IL-6,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,使用全自動(dòng)生化分析儀完成檢測(cè)。

    1.5 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 小鼠斷頸處死后取出腎臟組織,4%福爾馬林溶液固定,送交病理科制作組織蠟塊,4 μm厚切片后,脫蠟以及梯度乙醇脫水,蛋白酶K[10 μg/ml,0.1-M Tris,50 mM EDTA(pH 8)]滲透消化組織,室溫15 min,末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)反應(yīng)緩沖液處理10 min,37 ℃加入TDT反應(yīng)混合物60 min,最后3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)顯色,蘇木精復(fù)染。棕褐色著色為凋亡陽性細(xì)胞,每高倍鏡(200×)下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptosis index,AI),AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.6 Western blot檢測(cè) 小鼠斷頸處死后取出腎臟組織,取50 mg組織,液氮下研磨,加入胰蛋白酶消化細(xì)胞制造單細(xì)胞懸液,置冰上水中裂解細(xì)胞膜30 min,10 000 g離心20 min,取沉淀物加入細(xì)胞核裂解液作用20 min,離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉浸PVDF膜1 h,加入P65(1∶1 000)和Histone(1∶5 000)抗體,4 ℃孵育過夜后加入二抗,X-ray曝光顯色目的條帶,對(duì)照內(nèi)參Histone計(jì)算各組P65蛋白的相對(duì)灰度值。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠腎功能的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組Cr和BUN組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中低劑量組和高劑量組Cr和BUN顯著低于RIRI組(P<0.05和P<0.01),高劑量組Cr和BUN顯著低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

    表1 四組小鼠Cr和BUN比較

    2.2 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組MDA、SOD、TNF-α和IL-6組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中低劑量組和高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于RIRI組,SOD顯著高于RIRI組(P<0.05和P<0.01),而高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于低劑量組,SOD顯著高于低劑量組(P<0.05)。見表2。

    表2 四組小鼠SOD、MDA、TNF-α和IL-6比較

    2.3 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組AI分別為0.34%±0.05%、32.14%±3.46%、22.32%±3.17%和14.06%±1.53%,四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.317,P<0.01),其中低劑量組和高劑量組AI顯著低于RIRI組(P<0.01),而高劑量組AI顯著低于低劑量組(P<0.01)。見圖1。

    圖1 小鼠TUNEL細(xì)胞凋亡染色(200×)

    2.4 厄貝沙坦對(duì)RIRI小鼠NF-κB通路的影響 假手術(shù)組、RIRI組、低劑量組、高劑量組細(xì)胞核P65蛋白的相對(duì)灰度值分別為0.06±0.01、0.52±0.09、0.27±0.04和0.16±0.03,四組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.426,P<0.01),其中低劑量組和高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于RIRI組(P<0.01),而高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于低劑量組(P<0.01)。見圖2。

    圖2 小鼠P65蛋白的Western blot檢測(cè)

    3 討論

    臨床上約47%的AKI是由RIRI引起。RAS紊亂是腎損傷的主要途徑之一[6]。RAS紊亂可通過Ang Ⅱ 1型受體的直接作用導(dǎo)致腎小管損傷,臨床上給糖尿病腎病患者早期使用AngⅡ受體抑制藥物厄貝沙坦,可以延緩腎功能的惡化[7]。本研究發(fā)現(xiàn),低劑量組和高劑量組Cr和BUN顯著低于RIRI組,而高劑量組Cr和BUN顯著低于低劑量組,說明厄貝沙坦可以拮抗RIRI的腎損傷,而且呈劑量依賴關(guān)系。

    RIRI激發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié),研究顯示,抗氧化抗炎可以保護(hù)RIRI腎損傷[8]。李貴榮等[9]研究顯示,下調(diào)血管緊張素Ⅱ可以抑制大鼠肝臟缺血再灌注損傷。Kabel等[10]研究顯示,厄貝沙坦可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的肝損傷,MDA、SOD、TNF-α和IL-6是常用的氧化應(yīng)激炎癥監(jiān)控指標(biāo),本研究顯示,低劑量組和高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于RIRI組,SOD顯著高于RIRI組,而高劑量組MDA、TNF-α和IL-6顯著低于低劑量組,SOD顯著高于低劑量組,表明厄貝沙坦可以抑制RIRI小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。NF-κB是體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路,通路激活后P65蛋白入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用,調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá),促進(jìn)氧化炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡[11]。研究顯示,抑制NF-κB通路可以保護(hù)RIRI腎功能[12]。本研究顯示,低劑量組和高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于RIRI組,高劑量組細(xì)胞核P65蛋白相對(duì)灰度值顯著低于低劑量組,說明厄貝沙坦可以劑量依賴性地抑制RIRI小鼠NF-κB通路激活。細(xì)胞凋亡分析也顯示,低劑量組和高劑量組AI低于RIRI組,高劑量組AI低于低劑量組,說明厄貝沙坦可以劑量依賴性地抑制RIRI小鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡,對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能是通過抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。

    綜上所述,厄貝沙坦可以抑制RIRI小鼠NF-κB通路激活,抑制氧化炎癥反應(yīng),抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡,發(fā)揮RIRI損傷的腎臟保護(hù)作用。

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