lncRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的研究進展

何亞麗，毛玉娟，楊銳，江華，謝青，申進增，伊琳*，顧遠輝

（1.甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，甘肅 蘭州；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州）

0 引言

甲狀腺癌（thyroid carcinoma,TC）是最常見的內分泌腺惡性腫瘤。據2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據（GLOBOCAN 2018）顯示，甲狀腺癌已成為全球第11位常見癌癥，也是全球女性第5大高發(fā)癌癥，全球2018年新增甲狀腺癌病例56.7萬，約有4.1萬人死于甲狀腺癌[1]。據2018年國家癌癥中心最新發(fā)布數(shù)據顯示，我國甲狀腺癌總發(fā)病率為12.4/10萬，居惡性腫瘤發(fā)病率第7位，女性發(fā)病率居第4位，呈明顯上升趨勢近[2]。其中，甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)的增長是最快的，約占甲狀腺癌的85%～90%[3]。PTC早期易發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移，一些學者認為淋巴結轉移是局部復發(fā)和癌相關死亡率的高危因素之一。對于PTC來說遠處轉移是引起致死的主要原因，10%的PTC會出現(xiàn)遠處轉移。因此，找到特異性的分子標志物，闡明其侵襲轉移發(fā)生的機制，才能在甲狀腺癌的早期精確診斷和精準治療方面發(fā)揮重要作用。

1 lncRNA的概述

全基因組轉錄測序的結果顯示，對于哺乳動物，在其大多數(shù)基因中的蛋白質編碼區(qū)里，僅僅2%的基因，可以翻譯蛋白質。此類RNA被命名“非編碼 RNA( noncoding RNA,ncRNA) ”，其又劃分成管家ncRNA和調控ncRNA，而調控ncRNA又因分子結構的區(qū)別還可區(qū)分成3個分類:短非編碼RNA(short noncoding RNAs,sncRNAs)，中長非編碼RNA(mid-size noncoding RNAs,mncRNAs)和長非編RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)，lncRNA為ncRNA的一個基因片段，總長大于200nt，是一類非編碼剪切體，對蛋白質無法進行編碼。相較于小的非編碼RNA，lncRNA有著復雜的二級或三級結構，因此擁有多種作用機制，它可以多種形式調控靶基因：lncRNA可與DNA調控序列結合，阻止轉錄的起始；跨蛋白編碼區(qū)下游啟動子區(qū)域的非編碼RNA可直接干擾轉錄因子與蛋白編碼基因的結合或使相反鏈上的兩個RNA聚合酶發(fā)生碰撞，導致轉錄終止或抑制其表達；部分lncRNA可作為小分子RNA （microRNA 、piRNA等）的前體分子轉錄，從而影響小RNA的表達；lncRNA 還能通過與mRNA形成雙鏈復合物，掩蓋mRNA 的主要順式作用元件，在轉錄后水平調控基因表達。lncRNA同時參與DNA甲基化、染色質重塑、microRNA調控、蛋白質共價修飾的表觀遺傳學調控。研究表明lncRNA在腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移、分化中有舉足輕重的作用，會對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展產生一定影響[4]。

2 lncRNA在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用

越來越多的證據表明，lncRNA在甲狀腺乳頭狀癌中通過介導增殖、遷移、侵襲、淋巴轉移、凋亡等生物學特性影響著其發(fā)生、發(fā)展及預后情況，現(xiàn)將lncRNA在甲狀腺乳頭狀癌的表達和作用機制（表1）做一總結，以期更深入了解PTC的發(fā)生、發(fā)展、診治和預后。

2.1 與PTC增殖相關的lncRNA

2.1.1 BANCR

BRAF基因激活的非編碼RNA(BRAF-Activated long Non-Coding RNA,BANCR )是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因突變類型。研究發(fā)現(xiàn)BANCR在PTC組織中表達增高，在甲狀腺癌細胞系IHH -4中，敲除BANCR基因使甲狀腺激素受體（TSHR）表達明顯降低，而且會降低細胞周期蛋白D1的表達，使細胞分裂周期停留在 G0 /G1 階段，從而減慢細胞的增殖速度，過表達BANCR能夠激活細胞自噬，抑制細胞凋亡，從而促進甲狀腺癌細胞增殖。已有研究表明BANCR可促進甲狀腺癌細胞IHH-4的增殖和抑制其凋亡[5]。Khan等[6]也發(fā)現(xiàn)TSHR參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，而且TSHR的表達水平也與BRAFV600E的突變密切相關。但Liao等[7]構建了BANCR過表達載體并轉染TPC-1和K1細胞株，發(fā)現(xiàn) BANCR可抑制這兩種癌細胞的增殖，促進其凋亡。進一步體內實驗發(fā)現(xiàn)，BANCR負性調節(jié)PTC細胞質內的細胞外調節(jié)蛋白激酶 1/2（ERK1/2）和P38 的表達，通過ERK-MAPK 和PI3K-Akt通路信號通路抑制PTC細胞的增殖。BANCR在不同甲狀腺腫瘤細胞中對其增殖產生了相反的作用，其結果還需進一步研究證實。另有研究發(fā)現(xiàn)，過表達的BANCR可以通過c-Raf/MEK/ERK信號通路使BCPAP中腫瘤干性基因LGR5，EpCAM的表達量上升，細胞克隆形成能力以及微球體形成能力增強，從而在PTC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)均提示BANCR在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用，它可能是PTC的一個新的潛在靶點和預后因子。

2.1.2 GAS8-ASl

在16號染色體長臂端上，有生長抑制特異性基因8(Growth Arrest-specific Gene 8,GAS8 )，在GAS8的第二個內含子中有長鏈非編碼RNA GAS8 ASI。有研究發(fā)現(xiàn)GAS8-AS1 是中國 PTC患者中次要突變基因，進一步研究表明，GAS8-AS1突變與腫瘤分期密切相關，GAS8-AS1 的異常表達明顯抑制甲狀腺癌細胞增殖。Pan等[8]通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)GAS8-ASl在PTC患者的腫瘤組織中低表達，進一步在BCPAP和TPC-1進行細胞層面驗證，結果顯示，GAS8-ASI突變后抑制細胞生長的作用有所降低。并通過 GAS8-ASI基因敲低，觀察其表型，發(fā)現(xiàn)GAS8-ASI的沉默會讓細胞增殖能力增強，由此可知，GAS8-ASI的高表達會抑制腫瘤細胞生長，反之則會促進腫瘤細胞生長，并且GAS8-ASI基因若發(fā)生突變，則抑制腫瘤生長的能力會下降。Qin[9]等還發(fā)現(xiàn)GAS8-AS1過表達后，自噬相關基因 ATG5表達明顯上調，沉默ATG5減弱了自噬激活，并抑制了細胞的增殖，揭示了PTC細胞系中 GAS8-AS1-ATG5 軸的新機制，這為探索lncRNA在甲狀腺癌治療中對自噬的影響提供了新的實驗依據。Chen[10]等進一步研究闡明了Gas8-AS1通過負性調控miR-135B-5p調節(jié)其下游靶點Cyclin G2(CCNG2)，可能通過Gas8-AS1/miR-135B-5p-CCNG2軸抑制PTC細胞的生長。然而，PTC中的Gas8-AS1/miR135b-5p調控網絡非常復雜，需要后續(xù)更深入研究。

2.1.3 MEG3

在人類染色體14q32.3位點上，有長度為35 kb的一種印記基因，母體表達基因3(Maternally Expressed Gene 3,MEG3)起初被當做同源印記基因在小鼠Gtl2上問世，在正常組織中具有一定表達水平，大部分腫瘤組織中MEG3表達降低。崔大煒[11]研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在PTC癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，通過檢測其增殖能力，發(fā)現(xiàn)MEG3過表達后能顯著抑制癌細胞的增殖。有研究進一步證實，MEG3在基因轉錄時受到甲基化水平的調控作用，因而其基因表達受到抑制[12]。這表明lncRNA MEG3能夠通過抑制PTC的增殖從而抑制癌癥細胞生長，為甲狀腺癌新的治療靶點提供了有效的理論依據。最近的研究還發(fā)現(xiàn) LncRNA MEG3 通過海綿吸附miR-182增強甲狀腺癌的 131I 敏感性。

2.2 與PTC浸潤、侵襲相關的lncRNA

2.2.1 PTCSC3

乳頭狀甲狀腺癌易感性候選3 (Papillary Thyroid Carcinoma Susceptibility Candidate 3,PTCSC3)，是最新發(fā)現(xiàn)的有嚴格甲狀腺特異性核糖核酸。Jendrzejewski[13]通過qPCR法檢測了46例PTC組織及癌旁組織中PTCSC3的表達，結果發(fā)現(xiàn)PTC組織中PTCSC3的表達明顯低于癌旁組織。進一步實驗發(fā)現(xiàn)在PTC組織中，表達下降的PTCSC3，會導致S100A4蛋白的過表達，進而會加劇甲狀腺癌細胞的侵襲。曾有研究發(fā)現(xiàn) S100A4 表達異常的細胞中，血管內皮生長因子(VEGF) 和基質金屬蛋白酶-9( MMP-9)的表達水平也不正常[14]。通過檢測發(fā)現(xiàn)，在PTCSC3過表達的BCPAP 細胞中，VEGF和MMP-9的水平明顯降低，進而抑制BCPAP細胞的侵襲與轉移。此作用機制可能是PTCSC通過抑制S100A4的表達使VEGF和MMP-9的分泌受抑制，抑制甲狀腺癌細胞的侵襲與轉移。Hou等[15]等人通過實驗將攜帶長鏈S100A4 cDNA的質粒轉染BCPAP細胞后發(fā)現(xiàn)，BCPAP細胞的侵襲和運動能力明顯增加，表示S100A4基因過表達可促進甲狀腺癌細胞的侵襲，而MMP-13也參與了侵襲調控。靶向S100A4可下調MMP-13表達，從而抑制甲狀腺癌的侵襲。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)PTCSC3作為腫瘤抑制因子被研究為miR-5745的競爭內源RNA。PTCSC3通過吸附miR-574-5p，靶向于癌細胞侵襲抑制因子(SCAI)，SCAI可調節(jié)Wnt/β-catenin的活性。表明PTCSC3-miR574-5p-SCAI-Wnt/β-catenin信 號 通 路 介 導 了TPC-1細胞的增殖和遷移。

表1 lncRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達和作用機制

2.2.2 NEAT1

研究表明核富集素轉錄本1（Nuclear Enriched Abundant Transcript 1,NEAT1）與包括PTC 在內的不同惡性腫瘤的腫瘤進展密切相關。有研究[16]表明，NEAT1 在甲狀腺癌細胞中表達上調，過表達能夠促進甲狀腺癌細胞的侵襲，敲低NEAT1，則會降低裸鼠的細胞存活、侵襲和致瘤潛力。NEAT1還通過競爭性結合miRNA-214 來降低其功能，進一步促進甲狀腺癌細胞的惡性進展。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)NEAT1-2可以作為競爭內源RNA，通過海綿作用于PTC中miR-106b-5p來調節(jié)ATAD2的表達。靶向NEAT1-2通過下調致癌基因ATAD2 可明顯抑制惡性生物學行為，這可能成為PTC患者的一種有前途的治療策略。此外還有研究發(fā)現(xiàn) lncRNA NEAT1可通過上調miR-129-5p而抑制PTC組織中高表達的下游蛋白KLK7的表達，從而抑制PTC的進展。在放射性碘（RAI）治療PTC的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，NEAT1在RAI耐藥的PTC組織和細胞系中高表達，可通過促進增殖和抑制凋亡來抵抗RAI。說明過表達的NEAT1抑制了RAI對腫瘤的損傷。此外，NEAT1/miR-101-3p之間存在直接靶向的負相關關系?？筊AI PTC組織中過表達的下游蛋白FN1可被miR-101-3p下調，而被NEAT1恢復。綜上所述，抑制NEAT1可通過上調miR-101-3p/FN1的表達來抑制PTC對I的耐藥性。NEAT1在甲狀腺乳頭狀癌細胞發(fā)生中的作用表明，它可能是預后的生物標志物，亦可作為待發(fā)掘的治療靶標，有待進一步研究其潛在機制。

2.2.3 SNHG15

小核仁RNA宿主基因15(Small Nucleolar RNA Host Gene 15,SNHG15)是一保守非編碼1ncRNA，總長約200個核苷酸，定位于7號染色，與組織分化、細胞增殖、胚胎發(fā)育等過程密切相關。林勝[18]通過實驗發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者瘤體組織中1ncRNA SNHG15表達水平明顯高于健康人群，1ncRNA SNHG15在包膜浸潤的組織中表達水平明顯高于未出現(xiàn)包膜浸潤的組織。一項研究顯示1ncRNA SNHG15的過表達可能與瘤體組織的大小、血管侵犯等有關，沉默SNHG15基因表達可誘導其凋亡，其機制可能與aspase-3及Bax蛋白表達上調、Bcl-2蛋白表達下調有關，具體的作用機制目前尚不清楚[19]。Wu[20]等通過RT-PCR檢測92例PTC組織及癌旁組織發(fā)現(xiàn)，SNHG15在前者中的表達明顯高于后者。敲低SNHG15的表達，可顯著抑制PTC細胞遷移及上皮間質轉化( epithelialmesenchymal transition, EMT)過程，同時促進腫瘤細胞凋亡。通過RNA結合蛋白免疫沉淀實驗、熒光素酶報告實驗可知，SNHG15可作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，通過海綿化miR-200A-3p來使YAP1的表達上調，通過miR-200A-3 p/YAP1 /Hipp途徑促進PTC進展，可作為早期診斷和預后的評估指標。

2.3 與PTC淋巴轉移相關的lncRNA

2.3.1 HIT000218960

HIT000218960是一種新的長鏈非編碼RNA，長度為229bp。Li等[21]通過芯片篩查研究出1ncRNA HIT000218960的表達在PTC組織中顯著高于正常甲狀腺組織，且總結出它的高表達與TNM的細胞周期、淋巴結轉移及腫瘤多病灶特性有明顯關聯(lián)。并經過基因敲除實驗得出，HIT000218960在PTC細胞株(TPC1和BCPAP)中被敲除后，HMGA2的基因表達下調明顯，體外證實腫瘤細胞侵襲和轉移能力顯著下降。在PTC組織中，增加的HIT000218960在PTC組織中的表達與淋巴結轉移明顯相關。這表明在PTC中，HIT000218960可能通過調節(jié)HMGA2的表達而促進PTC細胞的轉移。

2.3.2 AP000472.2

有研究指出AP000472.2失調會介入轉移PTC的調節(jié)。Jiang等[22]通過RT-PCR檢測對60例甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤組織和癌旁組織發(fā)現(xiàn):在PTC組織中1ncRNA AP000472.2的表達水平顯著升高，與此同時，結合PTC組織的臨床病理特征發(fā)現(xiàn)：1ncRNA AP000472.2能促進甲狀腺乳頭狀癌的包膜侵犯和頸部淋巴結轉移。Ge[23]進一步通過慢病毒干擾實驗和慢病毒過表達實驗證實了，AP000472.2會促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的轉移能力。最后，通過體外實驗證實，1ncRNA AP000472.2可能通過抑制DEAR 1基因表達，進而激活TGF-β信號通路來促進癌細胞的發(fā)生發(fā)展。

2.3.3 UCA1

尿路上皮癌相關基因1（Urothelial carcinoma related gene 1, UCA1）在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。為了確定與PTC頸淋巴結轉移和預后相關的lncRNAs及其分子機制。Li[24]等研究發(fā)現(xiàn)UCA1在PTC組織中的表達水平明顯高于癌旁對照組織，并且在高表達的PTC組織中，轉移相關蛋白MMP-2和MMP-9的表達也增高。表明UCA1的上調與轉移相關蛋白的表達增加有關，提示它與PTC的淋巴結轉移有關，其表達水平顯著影響PTC患者的預后。此外，研究表明在PTC細胞系中，敲除UCA1基因可顯著抑制PTC細胞活力、集落形成和含溴結構域4(BRD4)的表達水平，并抑制體內PTC腫瘤的生長，而且UCA1可以調節(jié)PTC中miR-204的直接靶點Igfbp5的表達，可通過調節(jié)miR-204/Igfbp5軸在PTC中發(fā)揮癌基因活性。

2.3.4 lncRNA MEG3

在研究MEG3過表達后能夠顯著抑制TPC-1細胞的增殖能力的基礎上，為了探討MEG3基因對于甲狀腺乳頭狀癌細胞Snail2的表達是否起到了調控作用。崔大煒[11]通過PCR、蛋白質印跡法進行實驗研討，結果顯示，在MEG3基因過表達時，Snail2蛋白和mRNA的表達在TPC-1細胞中明顯降低，在腫瘤細胞轉移能力中有著重要的作用。Wang等[25]研究表明在具有淋巴結轉移的甲狀腺乳頭狀癌（PTC）組織中，MEG3明顯降低，且淋巴結轉移與MEG3低表達強烈相關。此外，由Luciferase實驗可知，轉錄后的MEG3可通過與3’UTR靶向結合，使Rac1的表達降低，顯示Rac1在轉錄后水平受到lncRNAMEG3的負調控。綜上可知，Rac1與MEG3在PTC組織中的表達呈負相關，因此MEG3靶向封閉Rac1成為細胞遷移的新型抑制途徑。

3 lncRNA在PTC診療及預后中的應用

最近十年，我國甲狀腺癌整體規(guī)范化診治水平及科研能力明顯提升，臨床病史，全面的體格檢查，超聲檢查的高分辨率技術，抽吸活檢應用細針穿刺技術，以及血清TSH水平檢測等成為準確診斷甲狀腺癌的基礎。其他影像學檢查, 如CT、MRI和18F-FDG PET等檢測可幫助評估甲狀腺原發(fā)腫瘤與周圍組織的解剖關系, 發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結和遠處轉移, 指導制定治療方案。有研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌組織中，miRNA let7a表達水平低于癌旁組織，而lncRNA H19的表達水平則高于癌旁組織。通過深入分析甲狀腺癌預后有關條件及臨床病理特征的關系,發(fā)現(xiàn)二者均與臨床分期相關聯(lián),隨著腫瘤的發(fā)展變化，lncRNA H19的表達會升高，而miRNA let7a的表達會則隨之下降。且lncH19表達上調者或者let7a表達下調者，5年生存率減低。說明miRNA let7a和lncRNA H19是影響甲狀腺癌預后的獨立危險因素，這表明了lncRNA可以通過調控miRNA在甲狀腺癌早期診斷和預后判斷中起到重要作用。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)可通過檢測穿刺組織中l(wèi)ncRNA的表達水平，或檢測血清中某種lncRNA的表達水平來診斷PTC，如BRAF突變、Ras突變、RET/PTC重排等。lncRNA還可以輔助超聲預測伴有淋巴結轉移的PTC，這些lncRNA可以作為新的微創(chuàng)診斷和預后生物標記物用于評估轉移性PTC。不僅方便快捷，而且能提高確診率，還有助于PTC的臨床預后預測。

4 小結與展望

伴隨醫(yī)療技術的進步，轉錄組測序和全基因組診斷方法也日趨完善，研究人員對lncRNA的關注度也漸漸提升。最近10年對lncRNA的探索不曾停止，1ncRNA的深層次潛能，在影響腫瘤進展上的獨特效果中得到了充分展示。以上研究表明1ncRNA在多個層面通過調控與甲狀腺癌相關的基因表達參與癌細胞增殖、浸潤、侵襲以及淋巴轉移，沉默1ncRNA的表達能夠有效降低或增高癌細胞的增殖、侵襲、轉移能力。另外，lncRNA能夠通過調控miRNA來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，表明有些 lncRNA 可能有著更為復雜的調控機制，從分子水平研究控制腫瘤生長、侵襲和轉移機制對腫瘤發(fā)生和治療至關重要，目前對于其具體的作用機制還有待進一步研究。而且，1ncRNA的表達量對甲狀腺癌患者的預后具有明顯的相關性，可作為癌癥早期篩查的生物學標志物，潛在治療靶點以及癌癥患者的預后預測指標。但目前的研究大多數(shù)關注了PTC，而對于其他預后更差的甲狀腺癌亞型研究的關注還遠遠不夠。在這些領域的進一步研究不僅可以促進對這些亞型的分子發(fā)病機制的理解，還可以改善這些亞型的診斷、治療和預后?？傊?，1ncRNA在甲狀腺癌增殖、侵襲、轉移的發(fā)生機制有待更深入的揭示，只有闡明其與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機制，才能為甲狀腺癌的分層診斷及精準治療及預后提供新方向。