人重組促紅細(xì)胞生成素對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

沈 印，葛 劍，李 喆，姚 樂

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury ，TBI)是神經(jīng)外科的常見疾病，在人類外傷性疾病的發(fā)病率中居第二位，具有很高的致死和致殘率[1]。TBI病理過程包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷(secondary brain injury,SBI)[2]。

原發(fā)性腦損傷是受傷當(dāng)時(shí)由直接機(jī)械損傷造成，SBI可在原發(fā)腦損傷數(shù)小時(shí)至數(shù)天后發(fā)生，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞鈣離子超載、自由基紊亂、脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡和彌漫性軸索損傷等[3]。原發(fā)性顱腦損傷無法干預(yù)，針對SBI，早期正確的臨床干預(yù)治療是降低TBI后病死率和致殘率的關(guān)鍵。近來研究表明促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,Rh-EPO) 在TBI后具有神經(jīng)保護(hù)作用。筆者觀察Rh-EPO對大鼠TBI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，探討其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠55只，鼠齡21周，體重(220±20)g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SPF(Specefic pathogen Free)級飼養(yǎng)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)批號：SCXK桂.No2014-001。

1.2主要試劑 Rh-EPO(沈陽三生制藥股份公司)；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、兔抗鼠Bcl-2 多克隆抗體及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)試劑盒(武漢博士德公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及模型建立 將55只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組(5只)、 TBI組(25只)及 Rh-EPO組(25只)；TBI組和Rh-EPO組按2、6、24、72、168 h時(shí)間點(diǎn)分為5個(gè)亞組，各5只。

將大鼠用鹽酸氯胺酮(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，其頭部固定于Myneurolab腦立體定向儀上；沿中線切開頭皮，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm、中線旁2.5mm處鉆孔并擴(kuò)大為5mm×5mm骨窗，保持硬腦膜完整。用美國BenchmarkTM顱腦損傷撞擊器撞擊硬腦膜(速度4m/s，撞擊面直徑2mm，深度2mm，接觸時(shí)間1s)，致右頂葉腦挫裂傷；硬膜外置明膠海綿止血，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，以上均為無菌操作。假手術(shù)組除不撞擊外，其他步驟同上。Rh-EPO組于TBI后立即經(jīng)腹腔注射Rh-EPO 5 000IU/kg，假手術(shù)組和TBI組經(jīng)腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)。假手術(shù)組于術(shù)后24h，模型建立后2、6、24、72、168h各組按時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本，過量麻醉后迅速斷頭取腦組織標(biāo)本。

2.2組織標(biāo)本檢查 處死大鼠后，取各組大鼠右頂葉相對完整腦皮層組織，用4%多聚甲醛溶液固定24～48h，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。采用光顯微鏡觀察組織學(xué)變化。

2.3免疫組織化學(xué)檢測 取各組大鼠右頂葉相對完整腦皮層組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24～48h后，石蠟包埋、切片。采用SP法檢測假手術(shù)組24h、TBI組、Rh-EPO組大鼠所取腦組織Bcl-2表達(dá)情況。操作按試劑盒說明進(jìn)行。在光學(xué)顯微鏡下觀察Bcl-2免疫反應(yīng)的結(jié)果，并采用圖像分析軟件進(jìn)行圖像定量分析，測定各組Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)。Bcl-2蛋白主要分布在胞漿內(nèi)，胞漿/胞膜有棕黃色物質(zhì)沉積為陽性細(xì)胞。每張切片在創(chuàng)傷灶周圍隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野(×400)進(jìn)行分析，Bcl-2用光密度(optical density，OD)值表示。

2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 (1)取假手術(shù)組右頂葉正常腦組織和其余兩組損傷灶處新鮮腦組織約100mg，用PBS清洗，吸出PBS。用剪刀盡量剪碎腦組織，并用PBS洗1次，吸凈PBS。(2)加入0.4%胰蛋白酶3.0mL，置于37 ℃水浴箱中水浴30min，其間不斷搖晃。并吸凈胰蛋白酶，用PBS洗1次，吸凈PBS。(3)加入PBS 3.0mL，反復(fù)吹打1～2min，呈單細(xì)胞懸液，用400目篩網(wǎng)過濾，在1 000r/min條件下離心5min，去上清液。(4)加紅細(xì)胞裂解液3mL，室溫下振蕩10min，在1 200r/min條件下離心10min，重復(fù)2次，去上清液。(5)加Bing buffer液190μL搖勻，加Annexin V 5μL避光染色10min，再加碘化丙啶(propidium iodide，PI)5μL，避光染色5min。應(yīng)用Epics XL流式細(xì)胞儀記錄氬離子激發(fā)光波長488nm處紅色熒光，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞凋亡的百分率作為檢測指標(biāo)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 各組病理改變

右頂葉打擊區(qū)域局部腦挫裂傷，腦組織腫脹，72h為最明顯。400倍光學(xué)顯微鏡下，TBI組可見腦組織有明顯的出血壞死灶、血管周圍間隙增寬、神經(jīng)細(xì)胞疏松，可見水腫、大量神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死、周圍伴有炎性細(xì)胞浸潤(圖1c)。Rh-EPO組各亞組壞死區(qū)及周圍水腫區(qū)范圍較TBI組縮小，周圍水腫減輕，變性壞死的神經(jīng)元細(xì)胞減少；假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)清晰，無腦組織腫脹，未見神經(jīng)細(xì)胞變性壞死(圖1a)。

2 各組Bcl-2水平比較

假手術(shù)組可見少量Bcl-2陽性細(xì)胞，TBI組2h后Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)增多，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；24h達(dá)高峰，72h出現(xiàn)下降。Rh-EPO組各亞組大鼠皮層可見大量Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)，與TBI組比較，Rh-EPO組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 各組大鼠腦組織Bcl-2免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元光密度比較

3 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

假手術(shù)組見少量凋亡細(xì)胞，TBI組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組明顯增高(P<0.01)，24h出現(xiàn)高峰。Rh-EPO組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率各亞組比TBI組低(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組大鼠TBI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較個(gè)/HP)

討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞接受某種信號后或受到某些因素刺激后一種主動(dòng)的、由多種基因蛋白相互作用引起的細(xì)胞程序性死亡，是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，在這一過程中Bcl-2基因家族起了重要的調(diào)控作用[4]。Bcl-2是凋亡抑制基因，可以阻止由鈣離子超載、膜過氧化、自由基損傷等因素引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其調(diào)控凋亡的機(jī)制可能是通過組織細(xì)胞色素C和DL-ATP從線粒體向胞質(zhì)釋放，引發(fā)caspase-9激活，抑制細(xì)胞凋亡[5-6]。TBI后神經(jīng)細(xì)胞的死亡主要表現(xiàn)為壞死和凋亡兩種形式。細(xì)胞凋亡是TBI后神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性死亡的主要機(jī)制，它加重了腦組織損傷的程度[7]。因此，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為TBI救治研究的新方向。

EPO是一種糖蛋白，相對分子質(zhì)量約為34 000，血漿中存在的EPO由165個(gè)氨基酸組成，主要在腎臟合成，作用于造血系統(tǒng)，是合成紅細(xì)胞主要刺激因子。近來研究發(fā)現(xiàn)，EPO等造血生長因子不僅參與造血的調(diào)控，且對神經(jīng)系統(tǒng)也具有直接保護(hù)作用[8]。EPO及其受體在神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)有表達(dá)，EPO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性細(xì)胞因子，通過神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的旁分泌作用，作用于神經(jīng)元EPO受體，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用[9]。Rh-EPO 是一種通過基因重組技術(shù)合成的糖蛋白，與天然EPO 有著相同氨基酸序列，生物學(xué)活性也相似。Rh-EPO也可在任何無損傷的情況下可以透過血腦屏障，通過Rh-EPO受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。大鼠腦室周圍白質(zhì)損傷模型(periventricular white matterdamage，PWMD)模型中，Rh-EPO促進(jìn)了腦白質(zhì)區(qū)的血管新生反應(yīng)[10]。在大鼠腦缺血性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯匡@示，Rh-EPO 可通過抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡及活化、阻斷興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、阻止一氧化氮生成及減輕炎癥反應(yīng)等，改善由低氧造成的神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-12]。在大鼠高氧腦損傷模型中[13]，Rh-EPO 可減少海馬神經(jīng)元損傷，減輕腦水腫程度。

筆者實(shí)驗(yàn)HE染色發(fā)現(xiàn)，顱腦皮層挫裂傷區(qū)及其周圍水腫區(qū)可見大量凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。Rh-EPO組壞死區(qū)及周圍水腫區(qū)范圍較TBI組縮小，周圍水腫減輕，凋亡細(xì)胞減少。Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，TBI組Bcl-2表達(dá)明顯較假手術(shù)組增高，而Rh-EPO組較TBI組表達(dá)增加，同時(shí)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，Rh-EPO組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯低于TBI組。

筆者研究表明，Rh-EPO能通過提高Bcl-2表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。Rh-EPO作為一種新型腦保護(hù)劑，目前成為研究熱點(diǎn)，也許在不久將來即可應(yīng)用于臨床治療TBI患者。