高壓氧治療對局灶性腦梗死大鼠的神經(jīng)保護作用

于秋紅，李婕，劉亞玲，王叢，任梓齊，薛連璧

迄今為止，腦梗死的治療思路主要有兩方面：一是盡快恢復(fù)缺血區(qū)域的血流，如動靜脈溶栓[1]和血運重建術(shù)[2]，二是神經(jīng)保護治療，但到目前為止，在動物實驗中證實有效的神經(jīng)保護藥物仍未在臨床試驗中獲得有力證據(jù)。綜合動物研究及臨床觀察，大部分研究支持高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療對于缺血性腦血管病是有益的[3]，其機制除了直接改善缺氧并減少缺氧導(dǎo)致的一系列病理損傷，還可能影響細(xì)胞的凋亡、缺氧誘導(dǎo)因子、腫瘤壞死因子等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)，起到神經(jīng)保護作用[4-5]。本課題組前期動物實驗研究提示，單次9 h HBO治療能促進腦新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)的建立[6]，影響細(xì)胞色素C及caspase-3，通過caspase依賴途徑影響細(xì)胞凋亡[7-8]，但是觀察時間點較少。本研究增加觀察時間點，并觀察HBO治療對非caspase依賴途徑細(xì)胞凋亡的影響，進一步探討HBO治療對局灶性腦梗死大鼠的神經(jīng)保護機制。

1 研究對象與方法

在非洲，要想真正把電商平臺運作起來是一件很困難的事。這里沒有“四通一達(dá)”，同城物流通常需要3到7天；由于買賣雙方的互信度差，當(dāng)?shù)仉娚毯芏嗖扇∝浀礁犊畹姆绞剑畲蟮娘L(fēng)險是貨到之后消費者反悔退貨，或者快遞員收錢后卷款跑路。

1.3 治療方法 采用上海減壓器廠生產(chǎn)的圓筒形透明有機玻璃實驗艙。HBO組造模成功后3 h開始HBO治療，升壓20 min，治療壓力0.2 MPa，穩(wěn)壓9 h，為避免氧中毒，大鼠穩(wěn)壓后第1、3、5、7、9 h呼吸純氧，第2、4、6、8 h呼吸空氣，減壓40 min。對照組大鼠造模成功3 h后，置于實驗艙內(nèi)不升壓，呼吸常壓空氣9 h。

1.2 模型制作及分組 采用改良Longa線栓法[9]制作大鼠永久性大腦中動脈閉塞模型：采用0.20 mm直徑的單股尼龍線制作一側(cè)圓鈍而富有彈性的小頭線栓，圓鈍線栓頭涂以牙科專用硅膠，用以阻塞左側(cè)大腦中動脈[6-8]。模型制備后3 h采用姿勢反射實驗對造模大鼠進行行為學(xué)評分[10]，評分1分或2分為造模成功，排除死亡、麻醉未清醒、無自主行動和無神經(jīng)功能缺損大鼠。造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組和HBO組，每組54只，于造模成功后3 h行神經(jīng)功能評分。

2.3 AIF在線粒體和細(xì)胞核的表達(dá)

（1）神經(jīng)功能評分：采用Garcia評分標(biāo)準(zhǔn)，該評分涉及6個方面：自發(fā)性行為、四肢活動的對稱性、前爪伸展、攀爬能力、身體的本體感覺、觸碰觸須的反應(yīng)；最高18分，最低3分，得分越高，神經(jīng)功能缺損越輕[6-8，11]。

（2）凋亡細(xì)胞數(shù)：大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，生理鹽水、4%甲醛灌殺，取前囟后3～6 mm處腦組織冰凍切片，厚20 μm，應(yīng)用TUNEL試劑盒，依照說明書操作行染色。冰凍切片浸入通透液，冰上促滲2 min，PBS沖洗3次，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液，濕盒中37 ℃反應(yīng)60 min，PBS沖洗3次，標(biāo)記為綠色熒光的是TUNEL陽性細(xì)胞，每樣本隨機選取缺血半暗帶5個鏡下視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

模型制作失敗和實驗中途死亡的大鼠，剔除數(shù)據(jù)后重新補充模型，并加以統(tǒng)計?？紤]到每只大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)的微小差異，本研究采用神經(jīng)功能評分改善情況：分別將造模后13 h、24 h、72 h處死前的Garcia評分與3 h評分相減，差值為正數(shù)表示神經(jīng)功能改善，差值為負(fù)數(shù)表示神經(jīng)功能惡化。

（4）MMPo：大鼠斷頭取缺血半暗帶腦組織剪成糊糜，加入消化酶A消化25 min，制成細(xì)胞懸液，加入羅丹明123染液，按說明書操作，孵育、離心、重懸細(xì)胞培養(yǎng)、離心、再重懸，流式細(xì)胞儀檢測羅丹明123熒光強度以觀察膜電位變化情況，激發(fā)波長488～505 nm，發(fā)射波長515～575 nm。熒光值越高，表示MMPo越低，反映線粒體功能越差，正常值為1067.96。

（3）AIF在線粒體和細(xì)胞核的表達(dá)量：大鼠斷頭取半暗帶腦組織，經(jīng)漂洗、研磨、過濾、反復(fù)離心，分離線粒體及細(xì)胞核，分別加入磷酸酶抑制劑、PBS緩沖液，振蕩、離心，提取線粒體及細(xì)胞核蛋白，使用AIF ELISA試劑盒按照說明書加入抗體、孵育、洗板、加入標(biāo)記酶二抗再孵育、洗板，加入顯色液孵育，用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，處理數(shù)據(jù)，得到AIF各時間點分別在線粒體和細(xì)胞核的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以形式表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)進行單因素方差分析（ANOVA），在方差具有齊性的條件下，若各時間點之間差異具有顯著性，采用Post Hoc中q檢驗（即Student-Newman-Keuls檢驗，SNK）和LSD法進行組間差異的兩兩比較；若方差不具有齊性，則選擇非參數(shù)檢驗進行總體差異的比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

對照組大鼠死亡5只，13 h內(nèi)2只，13～24 h、24～48 h、48～72 h內(nèi)各死亡1只，經(jīng)解剖證實死因為腦出血、腦水腫和蛛網(wǎng)膜下腔出血。HBO組治療過程中無死亡、癲癇發(fā)生。兩組大鼠3 h Garcia評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（對照組vsHBO組：8.21±0.86分vs8.43±0.81分，P=0.51）。

2.1 神經(jīng)功能評分改善情況 對照組各時間點Garcia評分改善整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），兩兩比較顯示，72 h改善最顯著，與13 h（P＜0.001）、24 h（P=0.003）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HBO組各時間點Garcia評分改善，整體差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其中72 h改善與13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

HBO組較對照組13 h（P＜0.001）、24 h（P=0.04）Garcia評分改善均更多，72 h兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 凋亡細(xì)胞數(shù) 每組大鼠缺血半暗帶區(qū)皆可觀察到大量凋亡細(xì)胞，對照組各時間點凋亡細(xì)胞整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），兩兩比較顯示，72 h凋亡細(xì)胞最少，與13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HBO組各時間點凋亡細(xì)胞數(shù)整體差異也有統(tǒng)計學(xué)意義，其中24 h較13 h凋亡細(xì)胞減少（P=0.02），72 h與13 h、24 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

HBO組較對照組13 h、24 h凋亡細(xì)胞數(shù)均更少（均P＜0.001），72 h兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

1.4 觀察指標(biāo) 每組54只大鼠按處死時間點分為造模后13 h、24 h、72 h亞組，每亞組18只，于處死前行神經(jīng)功能評分，處死后各取6只大鼠分別用于檢測凋亡細(xì)胞數(shù)、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）在線粒體和細(xì)胞核的表達(dá)量、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMPo）三種指標(biāo)。

2.3.1 AIF在線粒體的表達(dá) 如表3所示，對照組各時間點AIF在線粒體的表達(dá)整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），兩兩比較顯示，72 h最高，與13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h（P＜0.001）之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HBO各時間點整體差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其中72 h與13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

HBO組較對照組13 h、24 h及72 h各時間點AIF在線粒體的表達(dá)均更高（均P＜0.001）。

2.3.2 AIF在細(xì)胞核的表達(dá) 兩組AIF在細(xì)胞核中的表達(dá)趨勢相同，13 h均可見升高，24 h達(dá)到高峰，72 h明顯降低。如表4所示，對照組各時間點AIF在細(xì)胞核的表達(dá)整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），兩兩比較顯示，72 h最低，與13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h（P＜0.001）之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HBO各時間點差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），其中72 h與13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，13 h與24 h（P＜0.001）之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

HBO組較對照組13 h、24 h及72 h各時間點AIF在細(xì)胞核的表達(dá)均降低（均P＜0.001）。

2.4 MMPo 造模成功后13 h，對照組熒光值開始升高，24 h明顯升高（P＜0.001），提示MMPo下降；72 h時恢復(fù)至13 h水平附近（P=0.10），較24 h明顯下降（P＜0.001）。

其次，工作與生活的壓力，是產(chǎn)后抑郁的重要原因。部分女性因為懷孕與分娩，可能會錯失職場上升的機會，甚至?xí)G掉工作，加之因為寶寶的誕生，經(jīng)濟支出增加，會無形中給年輕媽媽增加焦慮。

HBO組熒光值相對穩(wěn)定于較低水平，提示MMPo穩(wěn)定于較高水平，13 h、24 h及72 h各時間點均較對照組低（均P＜0.001），提示對照組各時間點MMPo均低于HBO組（表5）。

3 討論

HBO治療的時間窗和劑量與其療效及毒性密切相關(guān)，一直是HBO學(xué)界研究的焦點之一。本課題組前期通過系列動物研究發(fā)現(xiàn)：在大鼠永久性大腦中動脈閉塞3 h開始，采用HBO單次持續(xù)9 h治療，一方面可提高內(nèi)源性血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進新生血管形成和側(cè)支循環(huán)建立[6]，另一方面通過降低細(xì)胞色素C和caspase-3，減少細(xì)胞凋亡[8]，體現(xiàn)了HBO神經(jīng)保護作用且并未產(chǎn)生額外的氧化應(yīng)激等損傷，這與多數(shù)學(xué)者的觀察一致[3-4]。在以上研究基礎(chǔ)上，本研究觀察了HBO通過非caspase依賴途徑對細(xì)胞凋亡的影響，以進一步探討HBO對局灶性腦梗死大鼠更多的神經(jīng)保護作用機制。

2)化學(xué)疏花疏果。采用西維因600～1 200倍液，在花后1～3周噴灑，對疏除部分幼果比較有效。也可在花后2～3周噴萘乙酸2～8毫克/升，或萘乙酰胺5～17毫克/升也有一定的效果。如果把握不好濃度和時間，會影響果實發(fā)育，因此要慎用。

師：是呀，文本以第一人稱介紹黑臉琵鷺，把黑臉琵鷺當(dāng)做人來寫，拉近了文本與讀者的距離，值得借鑒。我們同學(xué)們也可以學(xué)著他的樣子，讓你喜歡的小動物開口說話。

表1 神經(jīng)功能Garcia評分改善比較（單位：分）

表2 凋亡細(xì)胞計數(shù)比較

表3 AIF在線粒體的表達(dá)量比較（單位：ng/mL）

表4 AIF在細(xì)胞核的表達(dá)量比較（單位：ng/mL）

表5 線粒體羅丹明123熒光強度比較

對于大鼠永久性大腦中動脈閉塞模型，隨時間延長，腦梗死體積會擴大，從而進一步加重神經(jīng)功能缺損。分析原因，一方面是缺血半暗帶細(xì)胞在缺血缺氧得不到改善時發(fā)生死亡，另一方面是缺血缺氧導(dǎo)致能量缺乏時，細(xì)胞發(fā)生壞死而非凋亡，細(xì)胞壞死過程中溶酶體和細(xì)胞膜破裂會釋放溶酶體酶、興奮性氨基酸等物質(zhì)激活炎癥反應(yīng)從而使梗死體積擴大。其中，能量主要是在線粒體產(chǎn)生，從理論上來說，改善缺血缺氧或是改善線粒體功能都是腦梗死治療的策略。

1.1 實驗動物及試劑 選取108只SD清潔級雄性大鼠，體質(zhì)量280±20 g（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），大鼠實驗前禁食、不禁水3 h以上。實驗試劑包括水合氯醛、蔗糖，多聚甲醛、檸檬酸鈉、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、聚乙二醇辛基苯基醚（以上北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)），以及脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）試劑盒（Cat#KGA7044）、細(xì)胞懸液制備試劑盒（Cat#KGA829）、線粒體/細(xì)胞核提取試劑盒，大鼠凋亡誘導(dǎo)因子ELISA試劑盒，羅丹明123染色試劑盒（Cat#KGA217）（以上南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）。

本研究觀察到造模成功后13 h、24 h，HBO組神經(jīng)功能評分改善的程度較對照組明顯，顯示了HBO治療的療效。但兩組大鼠72 h神經(jīng)功能改善程度差異并不明顯，考慮與對照組出現(xiàn)死亡大鼠剔除數(shù)據(jù)后重新補充模型，而HBO治療后部分病重大鼠成活，從而拉低了HBO組神經(jīng)功能評分有關(guān)。本研究提示HBO挽救了半暗帶受損傷細(xì)胞，使之免于凋亡，減少了早期凋亡細(xì)胞，不僅與課題組前期觀察結(jié)果相同，與Zhou等[12]對HBO治療脊髓損傷的研究結(jié)果和He等[13]觀察到的HBO治療能減輕急性創(chuàng)傷性腦損傷的細(xì)胞凋亡也是一致的。從凋亡細(xì)胞數(shù)量看，13 h、24 h HBO組較對照組凋亡細(xì)胞數(shù)降低，而72 h兩組凋亡細(xì)胞數(shù)差別不大，這與HBO組13 h、24 h神經(jīng)功能改善優(yōu)于對照組是相符的，考慮是因為HBO干預(yù)及時，提供了充足的氧氣，一方面早期挽救了缺血周圍區(qū)部分休眠細(xì)胞，減少了13 h、24 h的凋亡細(xì)胞數(shù)，從而保留了相應(yīng)支配區(qū)神經(jīng)功能，所以13 h、24 h可見HBO組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較好。同時HBO治療后線粒體功能得以恢復(fù)，產(chǎn)生足夠能量，使不可挽救的腦細(xì)胞發(fā)生凋亡而非壞死，使得72 h凋亡細(xì)胞數(shù)有回升趨勢，同時避免細(xì)胞發(fā)生壞死而加劇神經(jīng)功能缺損惡化。

大學(xué)生是國家的未來和民族的希望，其身體素質(zhì)和健康狀況直接關(guān)乎國家的興衰發(fā)展。目前，我國開展了大、中、小學(xué)生的體質(zhì)健康狀況調(diào)查，但高職院校學(xué)生體質(zhì)健康狀況的調(diào)查卻較少。大多數(shù)高職院校學(xué)生畢業(yè)后即將走向社會，比其他學(xué)生更早的接觸社會，高職院校學(xué)生的體質(zhì)健康狀況，是學(xué)生體質(zhì)健康工作的重要組成部分。本研究于2014年對河南省高職院校在校學(xué)生體質(zhì)健康檢測資料進行分析，旨在了解和掌握高職院校學(xué)生的體質(zhì)健康水平，為更好的開展河南省學(xué)校衛(wèi)生工作，制定促進職高職院校學(xué)生體質(zhì)健康的措施提供科學(xué)依據(jù)。

從凋亡路徑來說，有caspase依賴性和非依賴性兩種線粒體凋亡。細(xì)胞色素C和caspase-3都是與caspase依賴性途徑有關(guān)的促凋亡因子[8，14-15]，caspase-3激活后，一方面直接降解多聚（ADP-核糖）聚合酶、蛋白激酶C等底物，另一方面激活其他的caspase蛋白酶類，共同參與底物的降解，直接啟動凋亡。本課題組前期亦有研究證實，HBO抑制caspase-3的釋放[8]。AIF等則主要引發(fā)非caspase依賴性凋亡途徑[15-16]。本研究觀察到：大鼠缺血后，AIF由線粒體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，而AIF再次穩(wěn)定于線粒體時與病情好轉(zhuǎn)、MMPo趨向于接近正常水平幾乎是同步的，兩組比較，HBO組MMPo維持在一個較高水平，AIF的核轉(zhuǎn)移降低，考慮HBO治療改善了氧供，線粒體功能得以恢復(fù)，一方面產(chǎn)生足夠的能量使細(xì)胞發(fā)生凋亡而非壞死，另一方面穩(wěn)定了MMPo，阻礙了AIF由線粒體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而抑制了AIF介導(dǎo)的非caspase依賴性凋亡途徑，減少了細(xì)胞凋亡。高壓氧治療使細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)得到改善，細(xì)胞恢復(fù)正常功能，神經(jīng)功能缺損也相應(yīng)得到改善。由此可見，雖然HBO治療只持續(xù)9 h，并間斷吸氧，但是明顯改善了缺血后大鼠腦組織缺血缺氧狀態(tài)，抑制了病理進展，發(fā)揮了神經(jīng)保護作用。

本研究尚存以下局限：①樣本量?。虎跒橛^察和統(tǒng)計學(xué)方便，取了固定時間點取材，但是觀察時間點與某些因子變化趨勢可能不太一致；③研究中缺血半暗帶取材是固定的，但它是一個動態(tài)變化區(qū)域，每只大鼠間也可能存在差異，所以取材定位與實際可能存在差異。

在ISO24444：2010關(guān)于防曬化妝品防曬指數(shù)測定方法中規(guī)定，可根據(jù)測定ITA°快捷準(zhǔn)確地預(yù)測受試者的 MED，因此參考引用 ISO24444：2010修改的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）也明確提出“可以根據(jù)受試者膚色 ITA°預(yù)測受試者 MED值”。

二是“合作組織模式”。多途徑推進政府、學(xué)校、行業(yè)、企業(yè)等主體參與貧困地區(qū)新型職業(yè)農(nóng)民培育工作。特別是發(fā)揮農(nóng)業(yè)主管部門、農(nóng)業(yè)院?；蜣r(nóng)廣校、鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)等機構(gòu)的積極性，利用不同主體間的資源優(yōu)勢形成合力。

【點睛】本研究證實早期單次長時間高壓氧治療可以改善大鼠神經(jīng)功能，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制凋亡誘導(dǎo)因子由線粒體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而影響細(xì)胞的凋亡，達(dá)到神經(jīng)保護作用。