運(yùn)動訓(xùn)練對急性腦梗死后學(xué)習(xí)記憶能力及細(xì)胞骨架蛋白的影響*

張維文 王曉莉 張方圓 方 玲 魏 琰（衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，衡水 053000）

腦梗死發(fā)病原因是由于腦內(nèi)動脈阻塞引起腦局部組織缺血缺氧壞死[1]。腦梗死患者所遺留的學(xué)習(xí)記憶能力障礙將嚴(yán)重影響患者本人和家庭生活質(zhì)量，影響身心健康。近期報道長期規(guī)律的運(yùn)動訓(xùn)練可提高腦外傷后的學(xué)習(xí)記憶能力[2]，可能與減少損傷腦組織氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)以及神經(jīng)元突觸可塑性等機(jī)制相關(guān)[3]。早期跑臺訓(xùn)練可以通過抑制巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞活化，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)促進(jìn)腦卒中老齡大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[4]。張青杰等[5]報道超早期和早期運(yùn)動訓(xùn)練可減少腦皮質(zhì)梗死邊緣區(qū)細(xì)胞壞死凋亡，改善急性腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙。本實(shí)驗采用大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，評價跑臺訓(xùn)練對于腦梗死大鼠梗死體積、腦水腫程度、空間學(xué)習(xí)記憶能力以及海馬區(qū)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。擬揭示早期運(yùn)動訓(xùn)練對于腦梗死大鼠的治療作用和其可能的作用機(jī)制，為此研究方向提供實(shí)驗和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF級 雄 性 成 年Wistar大 鼠120只，8周 齡，體質(zhì)量（250±50） g，由北京維通利華生物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21.0℃±1.0℃，濕度40%～55%， 自由飲食。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、訓(xùn)練組，每組40只。每組依據(jù)2個不同時間點(diǎn)（14、28 d）將動物分為2個亞組，每個亞組20只動物， 其中5只動物Morris水迷宮測試后行腦梗死體積測定；腦含水量檢測，免疫組織化學(xué)及免疫印跡檢測各5只動物。

1.2 藥品和儀器

兔抗大鼠β-tubulin和微管相關(guān)蛋白-2（microtube-associated protein-2， MAP-2）多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體購于北京博奧森生物有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；SABC免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA試劑盒與DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司；2， 3， 5一氯化三苯基四氮唑購自美國Sigma公司。電動跑臺儀（美國哥倫布儀器有限公司，Exer3/6R型）；大鼠腦立體定向儀（上海江灣醫(yī)療器械廠）；微量注射器（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 腦梗死模型制備

參照文獻(xiàn)[6]采用線栓法制備左側(cè)大腦中動脈閉塞模型。采用 0.8%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后將大鼠仰臥固定于臺上，分離左側(cè)頸總動脈，穿線備用；依次分離左側(cè)頸外動脈、頸內(nèi)動脈并依次結(jié)扎；動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端；在頸內(nèi)動脈與頸外分叉的近心端剪T型切口，將線栓輕插入頸內(nèi)外動脈，當(dāng)感到有阻力時，停止插線，距頸內(nèi)動脈與頸外動脈分叉處約（18.5±1.5） mm，證明線栓頭端已經(jīng)進(jìn)入大腦中動脈處，扎緊備線，消毒、縫合皮膚。大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)明顯右側(cè)偏癱體征及左側(cè)Horner征，證實(shí)造模成功，納入實(shí)驗，無此體征動物棄去。

1.4 跑臺運(yùn)動訓(xùn)練

手術(shù)前各組大鼠均在電動跑臺儀上進(jìn)行適應(yīng)性跑步訓(xùn)練3 d。運(yùn)動訓(xùn)練組大鼠于腦梗死模型制備成功后24 h給予跑臺訓(xùn)練，每天訓(xùn)練30 min。電動平板斜度為0，第1天運(yùn)動速度為4 m/min，第2天增加至 8 m/min，第3天增加至12 m/min，然后保持該速度分別訓(xùn)練至造模后14 d或28 d。假手術(shù)組及模型組每日亦置于跑臺上30 min，但不進(jìn)行跑步運(yùn)動。

1.5 Morris水迷宮測試

水迷宮水池直徑為100 cm，高60 cm，水深42 cm，平臺高度40 cm，沒于水面下2 cm。調(diào)節(jié)水溫至 22 ℃～ 24℃之間，保持水池周圍參照物不變。（1）定位航行實(shí)驗：實(shí)驗前對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，訓(xùn)練時隨機(jī)選擇1個入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間（即逃避潛伏期），每次訓(xùn)練間隔為60 s；如果大鼠120 s內(nèi)未找到平臺，將其引至平臺，潛伏期記為120 s。（2）空間搜索實(shí)驗：在最后一次訓(xùn)練后撤除平臺，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測其在120 s內(nèi)跨過原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)和在平臺象限停留時間。

1.6 腦含水量的測定

按干濕重法測定腦組織含水量，評估大鼠腦水腫程度?？焖贁囝^完整取出腦組織，迅速稱其濕重，然后放置于100℃高溫干燥箱內(nèi)，烘干48 h恒重后稱量其干重。腦組織含水量按Elliott公式計算：腦含水量（%）=（濕重一干重）／濕重×100%。

1.7 腦梗死體積測定

用2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑 （TTC） 染色法檢測大鼠腦梗死體積，大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，冠狀切片每組6片（2 mm），TTC染液中室溫染色30 min。使用Image J分析軟件分析梗死體積百分比。依據(jù)公式：腦梗死百分比=腦梗死體積/ 腦片體積×100%。

1.8 免疫組織化學(xué)顯色

石蠟切片機(jī)切片（5 μm），烤片后常規(guī)水化。用枸櫞酸鈉緩沖液（0.01 mo1/L）進(jìn)行高壓抗原熱修復(fù)1.5 min。3%H2O2室溫孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。5%BSA封閉，室溫孵育20 min，傾去血清。分別滴加相應(yīng)一抗：兔抗大鼠β-tubulin和MAP-2多克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜。PBS沖洗，5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min。PBS沖洗，5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素，37℃孵育10 min。DAB顯色，自來水沖洗，脫水透明、封片。

1.9 免疫印跡檢測

稱取100 mg海馬組織，加入蛋白裂解液1 mL和蛋白酶抑制劑1 μL中裂解，低溫組織勻漿后靜置30 min，低溫離心留取上清液。用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量濃度測定，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜以5%BSA封閉，分別滴加兔抗大鼠β-tubulin和MAP-2多克隆抗體（1∶500）、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。次日洗膜后滴加lgG-HRP抗體（1∶5 000），室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光液曝光，掃描并測定目標(biāo)蛋白吸光度值，與內(nèi)參β-actin比值后，做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變

本實(shí)驗在造模后14 d和28 d進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗和空間搜索實(shí)驗。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠測試逃避潛伏期延長，經(jīng)過平臺次數(shù)與平臺象限停留時間均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，跑臺訓(xùn)練組大鼠測試逃避潛伏期縮短，經(jīng)過平臺次數(shù)與平臺象限停留時間明顯延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠逃避潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間（n=5， ±s）Tab 1 Escape latency， times of crossing the platform and residence time in platform quadrant（n=5， ±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期、經(jīng)過平臺次數(shù)和平臺象限停留時間（n=5， ±s）Tab 1 Escape latency， times of crossing the platform and residence time in platform quadrant（n=5， ±s）

*P＜0.05 vs sham group； △P＜0.05 vs model group

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2.2 大鼠腦水腫程度的變化

干濕比重法檢測腦組織含水量結(jié)果顯示：模型組大鼠的腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），且模型組14 d腦水腫程度高于28 d組。與模型組相比，跑臺運(yùn)動訓(xùn)練組大鼠的腦組織含水量明顯降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明跑臺訓(xùn)練可減弱腦梗死大鼠的腦水腫程度（圖1）。

圖 1 各組大鼠腦組織含水量的比較Fig 1 Comparison of brain water content of rats in each group

2.3 大鼠腦梗死體積的變化

假手術(shù)組大鼠腦組織中未見梗死灶。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠14 d及28 d均有不同程度的梗死灶形成（P＜0.05）。與模型組相比，跑臺訓(xùn)練后大鼠腦梗死體積百分比顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明運(yùn)動訓(xùn)練可以縮小腦梗死體積，促進(jìn)腦損傷恢復(fù)（圖2）。

圖 2 各組大鼠腦梗死體積Fig 2 Cerebral infarct volume of rats in each group

2.4 大鼠海馬CA1區(qū)β-tubulin 的蛋白分布

β-tubulin陽性細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色，細(xì)胞核不著色，代表細(xì)胞骨架的完整性。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)可見較多β-tubulin陽性細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)深棕褐色。在模型組大鼠β-tubulin陽性細(xì)胞數(shù)量減少且表達(dá)較弱。跑臺訓(xùn)練可以增加大鼠海馬CA1區(qū)β-tubulin陽性表達(dá)（圖3）。

圖 3 大鼠海馬CA1區(qū)β-tubulin 免疫組織化學(xué)顯色， ×400Fig 3 Immunostaining of β-tubulin in the hippocampal CA1 region of rats， ×400

2.5 大鼠海馬組織β-tubulin與MAP-2 的蛋白表達(dá)變化

假手術(shù)組大鼠海馬β-tubulin與MAP-2呈較高的蛋白表達(dá)量，維持神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)與功能。模型 組14、28 d大 鼠 海 馬 組 織β-tubulin與MAP-2表達(dá)較相應(yīng)時間點(diǎn)假手術(shù)組顯著降低（P＜0.05）。與相應(yīng)時間點(diǎn)模型組相比，跑臺訓(xùn)練組大鼠海馬區(qū)β-tubulin與MAP-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05），但仍低于假手術(shù)組（圖4）。

3 討論

本研究采用線栓法建立MCAO大鼠缺血模型，以評估跑臺運(yùn)動訓(xùn)練對大鼠腦梗死后的保護(hù)性療效及相關(guān)作用機(jī)制。MCAO作為一種腦缺血的嚙齒類動物模型，被廣泛用于缺血性腦中風(fēng)的病理機(jī)制及潛在治療方法的基礎(chǔ)研究[7]。急性腦梗死發(fā)生后，興奮毒性谷氨酸信號激活、活性氧物質(zhì)爆發(fā)、炎癥介質(zhì)大量釋放等一系列復(fù)雜的分子事件，導(dǎo)致廣泛神經(jīng)元損傷和神經(jīng)功能嚴(yán)重缺損[8]。結(jié)果表明，在眾多類型神經(jīng)細(xì)胞中海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元對缺血狀態(tài)最為敏感，這些神經(jīng)元在學(xué)習(xí)和記憶功能中起著至關(guān)重要的作用[9]。研究顯示腦缺血后的被動回避記憶障礙與錐體神經(jīng)元的變性有關(guān)[10]。

本研究水迷宮檢測已經(jīng)證實(shí)腦梗死后大鼠存在嚴(yán)重的空間學(xué)習(xí)及記憶能力障礙，表現(xiàn)為逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)及平臺象限停留時間減少。接下來進(jìn)一步探討了大鼠腦梗死后早期給予跑臺訓(xùn)練干預(yù)的療效。多種形式的運(yùn)動訓(xùn)練（跑臺訓(xùn)練、網(wǎng)屏訓(xùn)練、平衡木訓(xùn)練和游泳訓(xùn)練等）已經(jīng)被證實(shí)可預(yù)防、恢復(fù)或改善多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括癡呆癥、帕金森病、抑郁和睡眠困難等[11]。本實(shí)驗Morris水迷宮實(shí)驗結(jié)果顯示：于運(yùn)動訓(xùn)練后14 d及28 d大鼠逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺次數(shù)及平臺象限停留時間增加，表明早期跑臺訓(xùn)練可以明顯改善大鼠腦梗死后的空間學(xué)習(xí)能力障礙。除此以外，在急性大鼠腦梗死模型中，也證實(shí)早期跑臺訓(xùn)練運(yùn)動訓(xùn)練可以減小腦梗死大鼠腦梗死體積、減輕腦水腫程度，有一定腦保護(hù)作用。

早期跑臺訓(xùn)練對急性腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙的恢復(fù)及其腦保護(hù)性療效已被證實(shí)，但是具體的療效作用機(jī)制尚未完全闡明。譚來勛等[12]研究表明運(yùn)動訓(xùn)練可增加腦梗死灶周圍 3- 3- 甲戊二酰輔酶還原酶基因轉(zhuǎn)錄與翻譯，有利于突觸重塑，最終促進(jìn)大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)。張逸仙等[13]報道跑臺運(yùn)動訓(xùn)練能夠促進(jìn)腦缺血后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與上調(diào)腦缺血周邊區(qū)TGF-β/Smad3信號通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究主要關(guān)注的機(jī)制問題：跑臺訓(xùn)練是否通過調(diào)控海馬CA1區(qū)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)修復(fù)損傷的錐體神經(jīng)元，進(jìn)而促進(jìn)腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的恢復(fù)。

神經(jīng)元細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)由肌動蛋白絲、微管和神經(jīng)絲組成。這些細(xì)胞骨架聚合物在直徑、亞細(xì)胞定位、機(jī)械剛度、極性、組裝動力學(xué)等方面存在差異，這導(dǎo)致了在神經(jīng)元中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能[14]。微管是軸突中形成一種剛性的軌道狀結(jié)構(gòu)，執(zhí)行胞體和軸突末端之間物質(zhì)傳遞。β-tubulin與 MAP-2是微管的重要結(jié)構(gòu)蛋白。MAP-2在神經(jīng)元的發(fā)育、分化、突起形成和突觸可塑性等方面起著重要作用[15]。本實(shí)驗結(jié)果顯示腦梗死大鼠海馬組織中β-tubulin 與MAP-2的蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著降低。與先前研究結(jié)果一致：β-tubulin 與MAP-2對于缺血損傷較為敏感，是腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的早期標(biāo)記物[16]。神經(jīng)元中的標(biāo)志性MAP-2表達(dá)能反映腦梗死后海馬區(qū)神經(jīng)元的存活和功能，預(yù)示后期神經(jīng)功能學(xué)改變。本研究結(jié)果顯示給予跑臺訓(xùn)練干預(yù)后，可以上調(diào)腦梗死大鼠海馬組織中β-tubulin與MAP-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)大腦海馬區(qū)損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)，進(jìn)而改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，急性腦梗死后大鼠可出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙，而早期跑臺訓(xùn)練可改善腦損傷所致空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙，及減少腦梗死體積及腦含水量。其作用機(jī)制可能與運(yùn)動訓(xùn)練增強(qiáng)大鼠海馬組織中細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白β-tubulin與MAP-2表達(dá)，提高神經(jīng)可塑性有關(guān)。