慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾通過(guò)下調(diào)白細(xì)胞介素6抑制損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中波形蛋白的表達(dá)

向 陽(yáng) 鐘占瓊 祝 琦 吳番娜 張 曉△

（1 江油市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江油 621700；2 成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 611137；3 成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，成都 610500）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷初期的炎癥反應(yīng)和后期星形膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的膠質(zhì)瘢痕是造成神經(jīng)功能障礙的重要原因[1]。在CNS損傷中，白細(xì)胞介素6（interleukin-6， IL-6）具有神經(jīng)保護(hù)和損傷的雙重作用[2]。初期炎癥反應(yīng)可以清除細(xì)胞碎片，促進(jìn)損傷區(qū)域修復(fù)，但是過(guò)度炎癥反應(yīng)，通常導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)行性壞死。通過(guò)適當(dāng)?shù)目寡赘深A(yù)措施，使機(jī)體維持一定的穩(wěn)態(tài)，有助于CNS損傷的恢復(fù)[3-5]。波形蛋白（vimentin， Vim）屬于細(xì)胞中間絲（intermediate filaments， IFs）蛋白家族成員[6]。CNS正常時(shí)，Vim在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量很少，但CNS受損后，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，Vim構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，

Vim也明顯表達(dá)[7]。過(guò)度膠質(zhì)化導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的生成，將會(huì)抑制神經(jīng)軸突再生。然而，IL-6和Vim在CNS損傷后的相互關(guān)系不清楚，IL-6是否通過(guò)調(diào)控Vim，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)化反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在體外制備星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型，用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6的表達(dá)，通過(guò)免疫熒光（immunofluorescence）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRTPCR）、免疫印跡、MTT實(shí)驗(yàn)探究Vim的表達(dá)變化，探討其變化對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)化的影響，最終為臨床治療CNS損傷提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

取3 d SD大鼠于75%乙醇中浸泡消毒，斷頭入無(wú)菌0.01 mol/L PBS培養(yǎng)皿中，夾取大腦皮質(zhì)入DMEM-高糖培養(yǎng)基，加入0.125%胰蛋白酶充分消化，用10% FBS終止消化，再加DMEM-高糖培養(yǎng)基反復(fù)吹打混勻，200目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，離心機(jī)離心10 min，1 000 r/min。吸棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸，制備單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)稀釋至密度為5×105/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱，每隔3 d全量換液。細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，用0.125%胰蛋白酶消化，經(jīng)過(guò)2次傳代，第3次接種于96孔板，接種濃度是5×104/mL；接種于6孔板，接種濃度5×105/mL。通過(guò)IF檢測(cè)GFAP含量，來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞純度。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞密度達(dá)到40%可進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。

1.2 細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)分載體組（Vector組）和病毒組（IL-6-RNAi-LV組）。IL-6慢病毒抑制液、陰性對(duì)照由華西神經(jīng)生物研究所提供并予以技術(shù)指導(dǎo)。載體組為1 μL陰性對(duì)照液加入到100 μL完全培養(yǎng)基中，病毒組為1 μL病毒工作液加入到100 μL完全培養(yǎng)基中，每個(gè)孔均加入陽(yáng)離子聚合物1 μL 1%凝聚胺溶液（polybrene，PB）。24 h后全量換液。轉(zhuǎn)染后2 d，用qRT-PCR檢測(cè)IL-6 mRNA表達(dá)，觀察病毒組是否成功抑制IL-6 mRNA。

1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷模型制備

病毒轉(zhuǎn)染后2 d做劃痕實(shí)驗(yàn)。用10 μL黃色槍頭在6孔板培養(yǎng)基中劃“井”字，平均間距1 cm，用0.01 mol/L PBS漂洗因劃傷掉落的細(xì)胞，然后加入完全培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在劃傷后0、12、24、48 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取材進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法

在劃傷后在0、12、24、48 h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。6孔板中每孔加入100 μL MTT試劑（避光），放入孵箱37 ℃ 4 h。拿出后吸出液體，加入1 mL DMSO，用加樣槍混勻，再將液體移到96孔板，每孔100 μL，放入酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm OD值。時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖，比較2組的細(xì)胞增殖。

1.5 免疫熒光染色

吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，使用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×1次，再加4%多聚甲醛室溫固定10 min，然 后 用0.01 mol/L PBS漂 洗3 min×3次。加入含3‰Triton X-100的5%羊血清溶液，放入孵箱37 ℃ 30 min。吸掉液體，每孔加入Vim（1∶400，mouse，博士德），GFAP（1∶300，rabbit，博士德），GFAP（1∶300，mouse，博士德）抗體各50 μL，然后將96孔板放入濕盒，再放入冰箱4 ℃過(guò)夜。用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。加入熒光二抗：488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶200）和羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶50）。二抗孵育溫度是37 ℃，30 min。0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。滴加DAPI溶液，盡快使用熒光顯微鏡于暗室中拍照。

1.6 qRT-PCR

吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3次。每孔加入TRIzol溶液0.5 mL，吹打收集混懸液，提取總RNA。采用試劑盒 （Vazyme Biotech， Nanjing， China）將 總RNA逆 轉(zhuǎn) 錄 成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)計(jì)大鼠內(nèi)參β-actin，Vim，IL-6的上下游引物序列和探針序列（表1），通過(guò)試劑盒（Vazyme Biotech， Nanjing，China）進(jìn)行定量PCR的測(cè)量。擴(kuò)增條件如下：95 ℃2 min，95 ℃20 s，52 ℃30 s，60 ℃40 s，循環(huán)45次。反應(yīng)體系在Bio-Rad CFX96TM型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。讀取Ct值，采用公式R=2-ΔΔCt計(jì)算IL-6和Vim相對(duì)表達(dá)量。

1.7 免疫印跡檢測(cè)

吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3。加入RIPA裂解液，將細(xì)胞從孔板上刮下，離心后棄上清， 加入提前解凍的5×SDS PEGF蛋白上樣緩沖液，沸騰變性10 min。本實(shí)驗(yàn)采用12%分離膠和5%濃縮膠，先80 V跑至所有樣品到達(dá)濃縮膠時(shí)，換120 V電壓，溴酚藍(lán)泳動(dòng)至距膠下緣1 cm以上時(shí)，切斷電源，過(guò)程約需2 h。PVDF膜用搖床TBST漂洗，10 min×3次，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗Vim（1：2 000，mouse，博士德）和β-actin（1：2 000，mouse，博士德）4 ℃過(guò)夜18 h， TBST于搖床漂洗10 min×3次，加入二抗（1：10 000，HRP-羊抗小鼠IgG，博士德），搖床室溫1 h。搖床TBST 15 min×3次。最后加入顯色混合液，于凝膠成像儀器中，采集圖像。

表1 引物和探針序列Tab 1 Sequence of primer and TaqMan probe

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS17.0軟件，本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，2組以上比較時(shí)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊行LSD檢驗(yàn)，不齊行Dunnett T3檢驗(yàn)。2組比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

2.1.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 1 d后觀察已有細(xì)胞貼壁，有些細(xì)胞已有突起伸出（圖1 A）。3 d時(shí)細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞體積明顯變大，突起長(zhǎng)度增加，并且部分細(xì)胞交織成網(wǎng)（圖1 B），7 d時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)基本鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加明顯（圖1 C）。第2次傳代時(shí)第7天， 星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)更加豐富，細(xì)胞之間相互交錯(cuò)，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1 D）。

2.1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定 傳代2代后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60 %～80 %時(shí)，進(jìn)行免疫熒光染色，形態(tài)清晰（圖2，見(jiàn)封三）。隨機(jī)選取10個(gè)顯微鏡視野，計(jì)數(shù)藍(lán)色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和紅色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，然后通過(guò)比值來(lái)計(jì)算星形膠質(zhì)細(xì)胞純度,結(jié)果為97%。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間下的星形膠質(zhì)細(xì)胞Fig 1 Astrocytes at different culture time

2.2 qRT-PCR檢測(cè)IL-6mRNA表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染2 d時(shí)病毒組和載體組的IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示IL-6-RNAi-LV組的IL-6 mRNA含量（0.000 031±0.000 001）較載體組（0.000 055±0.000 003）顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功，抑制IL-6 mRNA表達(dá)。

2.3 MTT檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖率

在損傷后24 h、48 h，IL-6-RNAi-LV組的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖率與載體組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 細(xì)胞增殖差異比較Fig 3 Comparison of cell proliferation

2.4 免疫熒光檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性

細(xì)胞劃傷后2 d檢測(cè)細(xì)胞中GFAP，可見(jiàn)其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均高度分布，IL-6-RNAi-LV組綠色熒光強(qiáng)度明顯低于載體組（圖4，見(jiàn)封三）

2.5 劃傷星形膠質(zhì)細(xì)胞后，Vim mRNA和蛋白表達(dá)變化及定位

qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞損傷模型制備后2 d時(shí)病毒組和載體組的Vim mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示IL-6-RNAi-LV組（0.003 45±0.001 2）相較載體組（0.006 7±0.001 2）顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞損傷模型制備后2 d時(shí)慢病毒組和載體組的Vim 蛋白含量。通過(guò)Image J 計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示IL-6-RNAi-LV組相較Vector組在2 d顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

通過(guò)免疫熒光觀察載體組和慢病毒組在細(xì)胞損傷模型制備2 d時(shí)Vim的定位，可見(jiàn)Vim主要在細(xì)胞質(zhì)高度表達(dá)。IL-6-RNAi-LV組綠色熒光強(qiáng)度明顯低于載體組（圖6，見(jiàn)封三）。

圖2 GFAP 免疫熒光染色×400。 A：GFAP+物質(zhì)（紅色）； B：DAPI 染細(xì)胞核呈藍(lán)色； C：重合圖像代表星形膠質(zhì)細(xì)胞.圖4 GFAP 免疫熒光染色，×200。A1 ～C1：載體組；A2 ～C2：病毒組。 A：綠色熒光代表星形GFAP 陽(yáng)性物質(zhì)； B：細(xì)胞核呈藍(lán)色；C：重合圖像.圖6 Vim 免疫熒光染色結(jié)果，×400。A1 ～C1：載體組；A2 ～C2：病毒組。 A：綠色熒光代表Vim 陽(yáng)性物質(zhì)； B：細(xì)胞核呈藍(lán)色；C：重合圖像.Fig 2 Immunofluorescence staining of GFAP， ×400. A： GFAP+ astrocyte（red）； B： DAPI（ blue） stains the nucleus； C： Merged images.Fig 4 Immunofluorescence staining of GFAP， ×200. A1-C1 ：Vector ；A2-C2 ：IL-6-RNAi-LV. A ：GFAP+ astrocyte（green） ；B： DAPI+ nucleus（blue） ； C： Merged images.Fig 6 Immunofluorescence staining of vimentin， ×400. A1-C1：Vector；A2-C2：IL-6-RNAi-LV. A： vimentin+ astrocyte（green）；B： DAPI+ nucleus（blue） ； C： Merged images.

3 討論

CNS損傷是一種嚴(yán)重?fù)p傷，因?yàn)槠鋸?fù)雜的病理生理機(jī)制，至今尚無(wú)有效的治療措施[8]。然而，CNS損傷后早期炎癥反應(yīng)和后期瘢痕形成對(duì)損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有重要影響。本研究在體外建立細(xì)胞劃傷模型，模擬CNS損傷，通過(guò)MTT、免疫熒光、qRT-PCR和免疫印跡檢測(cè)，研究IL-6對(duì)Vim的調(diào)控，了解抑制炎癥因子IL-6是否下調(diào)反應(yīng)性膠質(zhì)化相關(guān)因子Vim，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)化，有益于CNS損傷恢復(fù)。

圖5 慢病毒抑制IL-6后vimentin蛋白表達(dá)Fig 5 The protein expression of vimentin in astrocytes with IL-6-RNAi-LV

3.1 細(xì)胞選擇及模型建立

本實(shí)驗(yàn)選用星形膠質(zhì)細(xì)胞。在人體中，當(dāng)機(jī)體受到損傷后，細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化為損傷后的一個(gè)基本病理變化，過(guò)度膠質(zhì)化導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成，而膠質(zhì)瘢痕中最主要的細(xì)胞是活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象。在CNS損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)、分子功能學(xué)的改變，并隨著CNS損傷時(shí)間的推移而動(dòng)態(tài)變化，最初膠質(zhì)細(xì)胞活化是一種防御機(jī)制，旨在減少炎癥、重建血腦屏障，最大限度減少和修復(fù)最初的損傷[10]，但是當(dāng)抑制成分超過(guò)生長(zhǎng)刺激因子，抑制作用占主導(dǎo)時(shí)，抑制性成分如硫酸軟骨素蛋白多糖、NG2、諾氨酸激酶等的表達(dá)而成為機(jī)械性屏障[11]，在嚴(yán)重?fù)p傷情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化就會(huì)導(dǎo)致不可逆的膠質(zhì)瘢痕形成。在CNS內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多[11]，并且在CNS發(fā)育成熟后，星形膠質(zhì)細(xì)胞仍然具有分裂能力，在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)比神經(jīng)元細(xì)胞更加容易貼壁，存活率高，并且能夠穩(wěn)定傳代[12]，對(duì)外界刺激有良好反應(yīng)[13]。

本實(shí)驗(yàn)選用劃傷模型。在體外建立SD新生鼠大腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷模型，模擬體內(nèi)脊髓損傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生[14]，劃傷性損傷相比于谷氨酸等興奮性氨基酸造成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞損傷更加接近體內(nèi)組織機(jī)械性損傷[15]。

3.2 慢病毒抑制IL-6后Vim表達(dá)下調(diào)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

在本實(shí)驗(yàn)中，首先將培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分成病毒組和載體組，在轉(zhuǎn)染慢病毒后2 d，采用qRTPCR測(cè)量IL-6 mRNA表達(dá)量，確定轉(zhuǎn)染是否成功。因?yàn)椴《窘MIL-6的mRNA表達(dá)顯著低于載體組，表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。然后，建立星形膠質(zhì)細(xì)胞劃傷模型。

Vim是細(xì)胞骨架的主要成分，對(duì)其進(jìn)行干擾可能有效阻止膠質(zhì)瘢痕形成。Smith 等[16]通過(guò)納米材料轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA （siRNA-3WJs）抑制神經(jīng)炎性源因子Lcn2的表達(dá)，結(jié)果顯示Vim、GFAP表達(dá)降低，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞減少。Okada 等[17]使用改良紐約大學(xué)沖擊器造成大鼠脊髓鈍挫傷，腹腔注射IL-6R單克隆抗體（MR16-1）抑制IL-6表達(dá)，結(jié)果顯示MR16-1可以抑制IL-6 JAK/STAT信號(hào)通路，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，也抑制脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，還可以減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少瘢痕形成。Lepekhin等[18-19]采用GFAP和Vim基因雙敲除小鼠，在其腦或脊髓損傷后形成的膠質(zhì)瘢痕中，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)改變和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能缺陷，并且減少膠質(zhì)瘢痕形成。Larsson 等[20]采用18個(gè)月大的GFAP（-/-）Vim（-/-）小鼠為研究對(duì)象，雙基因敲除的小鼠海馬齒狀回顆粒層細(xì)胞增殖存活率比野生型對(duì)照組高34%，神經(jīng)再生率高36%，提示通過(guò)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，可以促進(jìn)健康老年小鼠海馬神經(jīng)再生。劃傷模型建立后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明慢病毒抑制IL-6后Vim表達(dá)下調(diào)。病毒組細(xì)胞在24 h和48 h增殖明顯低于載體組。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示病毒組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性程度，弱于載體組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示慢病毒干擾IL-6后，Vim的表達(dá)下調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化受到抑制，從而減少膠質(zhì)瘢痕形成，增加軸突可塑性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究保持一致。

在體外實(shí)驗(yàn)中，干擾IL-6的表達(dá)能夠下調(diào)Vim的表達(dá)，干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)化，從而抑制膠質(zhì)瘢痕生成。然而，人體內(nèi)的生理病理機(jī)制更為復(fù)雜，炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕形成之間的相互關(guān)系還需要進(jìn)一步深入探究。