大鼠脊髓背角Ⅱ、Ⅲ層神經(jīng)元的高爾基染色特征*

邵采鳳 趙明薇 陳 茜 楊 鯤，3△

（1 南通市中醫(yī)院，南通大學(xué)附屬南通中醫(yī)院麻醉科，南通 226001；2 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，鎮(zhèn)江 212013；3 Department of Neurology，School of Medicine，University of Maryland Baltimore 21201，USA）

脊髓背角是接受、調(diào)控并上傳傷害性信息的初級門戶[1]。按照Rexed分層，脊髓背角Ⅱ?qū)訛橹饕芍虚g神經(jīng)元組成的半透明膠狀質(zhì)（substantia gelatinosa）[2]。曾長期認(rèn)為Ⅱ?qū)由窠?jīng)元以含γ-氨基丁酸（GABA）和/或甘氨酸（glycine）的抑制性中間神經(jīng)元為主，但近年的研究表明，該層興奮性中間神經(jīng)元占多數(shù)[3]。因?yàn)棰驅(qū)釉谕从X研究中十分重要，研究人員曾用多種方法（尼氏染色、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞內(nèi)示蹤劑注射、病毒示蹤等）對其神經(jīng)元的形態(tài)進(jìn)行了觀察[1，4]。意大利神經(jīng)科學(xué)家卡米羅·高爾基（Camillo Golgi）于1870年發(fā)明的銀染方法（高爾基染色法），一個半世紀(jì)后的今天仍是一種重要的神經(jīng)解剖學(xué)基本方法[1，5]。高爾基染色法可以定性和定量地觀察神經(jīng)元的胞體及軸突和樹突分支及走向，樹突棘的形態(tài)和數(shù)量，其具體實(shí)驗(yàn)方法至今仍然在被不斷地創(chuàng)新發(fā)展[5-8]。20世紀(jì)70～90年代有人利用高爾基染色將Ⅱ?qū)由窠?jīng)元分為島細(xì)胞（islet cell）和柄細(xì)胞（stalked cell），實(shí)驗(yàn)標(biāo)本涉及了貓、大鼠、靈長類等[4，9-13]。位于Ⅱ?qū)痈箓?cè)的Ⅲ層神經(jīng)元主要由較大細(xì)胞組成，也參與傷害性信息的調(diào)控[4]，其樹突表達(dá)與傷害性信息傳遞有關(guān)的P物質(zhì)（substance P， SP）受體并以“容積傳導(dǎo)”（volume transmission）方式接受終止于Ⅰ、Ⅱ?qū)拥某跫墏魅肽┥襍P的釋放[14]。Beal等[13]首次報(bào)道直接在同一切片上觀察Ⅱ、Ⅲ層神經(jīng)元的高爾基染色，分析了獼猴脊髓腰膨大節(jié)段膠狀復(fù)合體（gelatinosal complex， 包括脊髓Ⅱ?qū)雍廷髮樱┑母郀柣旧攸c(diǎn)，發(fā)現(xiàn)此相鄰2層都顯示多種形態(tài)特征的胞體和突起，且層界限模糊。該文將上述結(jié)果與Gobel在貓的Ⅱ?qū)拥难芯縖9]相比較，認(rèn)為獼猴和貓可能因?yàn)槲锓N不同而導(dǎo)致不同結(jié)果（Gobel報(bào)告稱貓的Ⅱ?qū)优c鄰層形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯不同）。大鼠是常用實(shí)驗(yàn)動物，因此有必要直接比較大鼠脊髓Ⅱ、Ⅲ層高爾基染色特征。鑒于此，本研究在參考前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行成年大鼠脊髓腰段高爾基染色，并在冠狀和矢狀面觀察Ⅱ?qū)蛹捌湎噜彽蘑髮由窠?jīng)元的染色結(jié)果，同時總結(jié)其突起走向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

采用成年SD大鼠7只，雌雄不限（江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心或馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供），年齡5～8周，體質(zhì)量180 g～220 g。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件下（22℃～25℃），保持正常的晝夜生物節(jié)律，動物可自由攝取水和食物）飼養(yǎng)。高爾基染色試劑盒（FD Rapid GolgiStainTMKit）購自FD NeuroTechnologies， Inc. （美國馬里蘭州Catonsville），用于Golgi-Cox染色。

1.2 高爾基染色及方法

將大鼠用異氟烷吸入麻醉后，斷頭，行脊柱椎板切除術(shù)，暴露胸下部至腰骶部脊髓，細(xì)心摘出將其放置于冷的人工腦脊液內(nèi)，于解剖鏡下剝離蛛網(wǎng)膜和軟脊膜，修去多余節(jié)段，保留第1腰椎～第2骶椎（L1～S2）節(jié)段。按照產(chǎn)品說明書步驟行高爾基染色：（1）雙蒸水滌蕩洗去多余腦脊液后置于浸染液（A液B液混合；分別為重鉻酸鉀和氯化汞）10 d，室溫下避光保存，其中浸染第1個6 h后和次日各更新液體1次；（2）將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至C液（含鉻酸鉀），4℃避光保存48 h～7 d；第1個6 h更新溶液；（3）染色結(jié)束后沉入含15%甘油（體積比）+ 20%蔗糖（質(zhì)量比）的雙蒸水24 h；（4）用冷凍切片包埋劑OCT （Sakura Tissue-Tek）包埋并冷凍，恒冷箱切片機(jī)（Leica CM1950）于-20℃～-22℃箱內(nèi)切成厚度為100 μm的冠狀或矢狀片；（5）將切片按順序裱于掛明膠的載玻片上，室溫下自然晾干（防塵避光）。脫水（50%、75%、95%乙醇各4 min，最后于100%乙醇4次，每次4 min）、透明（二甲苯3次，各4 min）；（6）以中性樹膠封片劑（Permount TM mounting medium）封片，顯微鏡下觀片。

1.3 信息采集

冠狀切片按Rexed分層法將脊髓灰質(zhì)分層，矢狀切取最大高度片。根據(jù)立體定位圖譜和實(shí)際測量，無論冠狀切或矢狀切，均從背側(cè)表面向腹內(nèi)側(cè)20～100 μm處 為Ⅱ?qū)樱?向 腹 內(nèi) 側(cè)40 μm為Ⅲ層。在徠卡DMRX型光學(xué)顯微鏡下觀察，利用QCapture 6.0版軟件進(jìn)行觀片、分析，圖像采集并保存為tif格式文件。主要觀察：（1）軸突和樹突的分支特點(diǎn)；（2）樹突上樹突棘的特點(diǎn)（有無、密度）；（3）突起的跨層特征等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用Graphpad Prism 6 （Graphpad Software， 美國加州San Diego）做統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

在冠狀切脊髓可見飛蝶狀灰質(zhì)，無論冠狀面或矢狀面，各層均有高爾基染色陽性神經(jīng)元，以Ⅲ～Ⅵ層最為密集（圖1A1、B1）。高倍鏡下可見Ⅱ?qū)由窠?jīng)元細(xì)胞胞體較小，直徑為（14.5±0.9）μm （n=13個神經(jīng)元；來自7只大鼠，每只最多2個神經(jīng)元）；其與Ⅲ層之間界限不明顯，此結(jié)果和大鼠活體腦薄片有明確界限不同。這些差異可能是因?yàn)樵诠跔钋忻嫔希?層細(xì)胞的突起在腹背方向或/和內(nèi)外側(cè)方向表達(dá)結(jié)果類似[13]。Ⅱ?qū)由窠?jīng)元有的局限于本層內(nèi)（即位于表面開始向腹內(nèi)側(cè)20～100 μm范圍內(nèi)），也有神經(jīng)元樹突伸向內(nèi)或外側(cè)并超過膠狀質(zhì)范圍。而Ⅲ層神經(jīng)元胞體直徑（21.8±1.7）μm（n=12個神經(jīng)元；來自7只大鼠，每只最多2個神經(jīng)元）較Ⅱ?qū)语@著增大（P＜ 0.01）。高倍鏡下進(jìn)一步分析，可見Ⅱ?qū)由窠?jīng)元銀染胞體數(shù)量相對較少，棘突密度不一，數(shù)量為（2.27±0.45）個/10 μm樹突。部分神經(jīng)元突起有較豐富的棘突[每10 μm樹突多于2個，（3.65±0.54）個；n=7]（圖1C1）；部分神經(jīng)元突起較光滑，棘突稀疏[每10 μm樹突少于或等于2個，（1.2±0.7）個；n=6](圖1C2），提示Ⅱ?qū)由窠?jīng)元可能在接受和調(diào)制傷害性信息上有不同功能。

與冠狀面結(jié)果不同，在矢狀切面可見Ⅱ?qū)觾?nèi)著色神經(jīng)元數(shù)量較Ⅲ層少，邊界清晰（圖1B1）；吻尾方向有較多的該層神經(jīng)元突起且較長（有1例自胞體發(fā)出后，跟蹤長度達(dá)550 μm）；突起上多見棘突（4.86±0.69）個/10 μm樹突（圖1C3），較Ⅱ?qū)由窠?jīng)元的平均棘突數(shù)量為多（P＜0.01）。同冠狀面的結(jié)果，Ⅲ層神經(jīng)元的胞體在矢狀切上也較Ⅱ?qū)哟螅▓D1D），有向背側(cè)發(fā)出的軸突穿過Ⅱ?qū)樱▓D1B2）。

圖1 大鼠脊髓灰質(zhì)的高爾基染色Fig 1 Golgi-staining of the gray matter in the spinal cord

3 討論

20世紀(jì)70年代，在Rexed分層的基礎(chǔ)上，Gobel在其系列高爾基染色工作中，將三叉神經(jīng)脊束核的膠狀質(zhì)（Ⅱ?qū)樱┥窠?jīng)元按照胞體和突起特征分為島細(xì)胞、柄細(xì)胞和其他細(xì)胞3類；前2類占絕大多數(shù)，而不能歸為這2類的則命名為“其他細(xì)胞”[9-10]；由此奠定了Ⅱ?qū)由窠?jīng)元分類的基礎(chǔ)[9]。參照Gobel方法，Todd和Lewis在大鼠的脊髓膠狀質(zhì)觀察到突起局限于膠狀質(zhì)層的島細(xì)胞及柄細(xì)胞各占染色陽性的細(xì)胞總數(shù)約1/3[11]。本研究在成年大鼠的冠狀和矢狀面上觀察了Ⅱ、Ⅲ層脊髓背角神經(jīng)元的高爾基染色，比較了Ⅱ、Ⅲ層著色神經(jīng)元的胞體大小、突起分布等特性。結(jié)果表明，Ⅱ?qū)由窠?jīng)元的胞體較Ⅲ層小，有的細(xì)胞軸突缺乏豐富的棘突，可能對應(yīng)為島細(xì)胞[11]；Ⅱ?qū)油黄鹪诟贡硞?cè)方向和吻尾方向均較多；而Ⅲ層神經(jīng)元在腹背側(cè)和吻尾側(cè)也均較多，結(jié)果與上述研究基本一致，進(jìn)一步直接比較了Ⅱ、Ⅲ層在同一條件下（同一張切片）的高爾基染色特征。Ⅱ、Ⅲ層神經(jīng)元的高爾基染色特征在棘突多寡和胞體直徑上均有不同。

高爾基染色法在早期研究中確立了神經(jīng)元輪廓及突起的行走方向等神經(jīng)細(xì)胞的基本構(gòu)架，在細(xì)胞內(nèi)辣根過氧化物酶、生物素、熒光標(biāo)記法出現(xiàn)的時代，高爾基染色法仍然是重要的神經(jīng)解剖學(xué)手段[1，15-16]。但其方法不穩(wěn)定，不易掌握。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了商品化高爾基染色試劑盒可以得到理想染色結(jié)果。特別需要指出的是，取材時組織是否需要固定，各家報(bào)道有差別，本實(shí)驗(yàn)沒有經(jīng)心沖洗血液，也未用固定液處理，但也得到理想效果，說明富含過氧化物酶的血液紅細(xì)胞對高爾基染色結(jié)果影響不大。既往針對脊髓背角特別是Ⅱ?qū)蛹?xì)胞的研究，已經(jīng)證實(shí)Ⅱ?qū)由窠?jīng)元具有多種多樣的形態(tài)學(xué)及電生理學(xué)特性[8，17-18]。結(jié)合其他報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)觀察到的神經(jīng)元與胞內(nèi)注射取得的結(jié)果一致，但高爾基染色法可同時顯示多個神經(jīng)元，更適合同時觀察多個神經(jīng)細(xì)胞的分布和樹突軸突走向。

Ⅲ層神經(jīng)元在結(jié)構(gòu)上和Ⅱ?qū)佑心承╊愃?，但主要接受初級傳入的有髓纖維[1]。尼氏染色顯示Ⅲ層神經(jīng)元數(shù)量實(shí)際上少于Ⅱ?qū)覽1]，然而本實(shí)驗(yàn)中觀察到在矢狀切面上Ⅱ?qū)臃炊^稀疏，2個結(jié)果的差異可能是由高爾基染色的特點(diǎn)引起的：高爾基染色只能浸染少數(shù)神經(jīng)元，正是這個特點(diǎn)使得高爾基染色法可以在“厚片”上獲得少數(shù)浸染細(xì)胞而利于追蹤突起走向和軸突上細(xì)小的棘突；但高爾基染色實(shí)驗(yàn)中何種細(xì)胞可被浸染，至今機(jī)制仍不明確[1，5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示在利用高爾基染色法時要注意其染色特點(diǎn)。本研究觀察到Ⅱ?qū)雍廷髮蛹?xì)胞的差異也提示此2層神經(jīng)元在參與傷害性信息的傳遞和調(diào)控中可能扮演不同角色[2，17]。