尹雪蓮 楊光 馬東杰 蘇哲君 霍峰 王鵬
(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科,河北 承德 067000;2秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院手術(shù)室)
口腔鱗癌是一種非常常見的口腔頜面部的惡性腫瘤之一,威脅人類的生命健康安全〔1〕。miRNA為長度在18~25個核苷酸之間的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用受到關(guān)注〔2,3〕。miR-19-3p在多種癌癥表達失調(diào),但其在口腔鱗癌中的作用機制仍需繼續(xù)探索。甲狀腺癌相關(guān)基因(TC)-1位于8p11~12,是一種含106個氨基酸編碼的固有無序蛋白,廣泛表達多種組織器官中,其在許多信號通路中均起重要作用,例如Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路,且參與許多癌癥的發(fā)展〔4,5〕。但miR-19-3p在口腔鱗癌中與TC-1的相互作用關(guān)系尚未清楚。本研究旨在探討miR-19-3p對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控機制。
1.1材料 31例口腔鱗癌癌旁組織和39例口腔鱗癌組織均來自承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2018年2~12月接受外科手術(shù)切除的病例?;颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。人口腔鱗癌細胞CAL27、Tca8113均購自美國菌種保藏中心;胎牛血清購自杭州四季青;DMEM培養(yǎng)基購自北京康為世紀(jì);CCK-8試劑購自日本同仁;胰蛋白酶購自美國GIBCO公司;LipofectamineTM3000試劑購自Invitrogen公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自;qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;Transwell小室購自美國Corning公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京森貝伽公司;雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自上海碧云天生物研究所。
1.2細胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10 %胎牛血清+1%雙抗)培養(yǎng)人口腔鱗癌細胞CAL27、Tca8113,在37℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。
1.3細胞分組 將miR-19-3p mimics、miR-NC、pcDNA、pcDNA-TC-1、miR-19-3p+pcDNA、miR-19-3p+pcDNA-TC-1與3倍量的脂質(zhì)體混合均勻,再與CAL27細胞共培養(yǎng)8 h,添加新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。將其分別標(biāo)記為miR-19-3p組、miR-NC組、pcDNA組、pcDNA-TC-1組、miR-19-3p+pcDNA組、miR-19-3p+pcDNA-TC-1組。用于后續(xù)的qRT-PCR、Western印跡實驗、CCK-8、Transwell實驗和流式細胞術(shù)實驗。
1.4qRT-PCR實驗 將需要檢測的細胞或充分研磨的組織勻漿用RNA抽提試劑盒提取RNA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA、qRT-PCR試劑盒進行miR-19-3p、LRIGl檢測。用2-△△Ct計算miR-19-3p、LRIGl的表達。
1.5Western印跡實驗檢測細胞TC-1、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、Bax、Bcl-2、E-鈣黏蛋白(cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達 將待檢測細胞用裂解液在冰上裂解30 min,提取總蛋白,并進行定量、變性。蛋白電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,再用2.5%脫脂奶粉室溫封閉處理2 h。加入稀釋過的Ⅰ抗溶液(1∶500~2 000),4℃孵育12~14 h。加稀釋過的Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗),37℃ 孵育2 h。最后用ECL加發(fā)光液進行顯影曝光。
1.6CCK-8法檢測細胞增殖 將需要檢測的細胞調(diào)整至5×105個/ml,取100 μl至96孔板,加入CCK-8反應(yīng)液,在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。
1.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 將待檢測的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,再用 500 μl 結(jié)合緩沖液懸浮,按照 Annexin V-/FITC試劑盒要求操作,加入染色液,最后上流式細胞儀檢測分析凋亡情況。總凋亡率(%)為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。每個樣品重復(fù)3次,實驗重復(fù)2次。
1.8Transwell小室檢測細胞遷移侵襲 將待檢測細胞按106個/孔接種細胞6孔板,用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。再將細胞調(diào)至105個/ml,取100 μl平鋪在小室的上表面,600 μl含血清的培養(yǎng)基加入小室的下室,將小室在37℃反應(yīng)12 h。取出小室,除去上室膜上的細胞,再用甲醇固定、結(jié)晶紫染色。然后再顯微鏡下觀察細胞數(shù)量并計數(shù),取平均值。
1.9雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測細胞熒光活性 根據(jù)mircode在線網(wǎng)站(http://www.mircode.org/)預(yù)測到的miR-19-3p與TC-1之間的結(jié)合位點,化學(xué)合成野生型TC-1基因序列(TC-1-WT)和突變型TC-1序列(TC-1-MUT),并將其克隆到熒光載體psiCHECK-2,建立熒光素酶報告基因質(zhì)粒,提取質(zhì)粒DNA。將其與miR-NC、miR-19-3p共轉(zhuǎn)染。按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊要求操作。結(jié)果用海腎熒光素活性與螢火蟲熒光活性的比值表達細胞的熒光活性。
1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用PEMS2.2軟件進行統(tǒng)計分析,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗,兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。
2.1miR-19-3p在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達 與癌旁組織(1.13±0.08)相比,口腔鱗癌組織中miR-19-3p表達(0.28±0.02)顯著降低(t=63.995,P=0.000)。
2.2miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27、Tca8113增殖的影響 與miR-NC組相比,miR-19-3p組CAL27、Tca8113細胞中miR-19-3p表達上調(diào),CyclinD1蛋白表達下調(diào),P21蛋白表達升高,24、48、72 h細胞活性降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖1。選用miR-19-3p過表達作用效果較明顯的細胞CAL27做后續(xù)實驗。
表1 miR-19-3過表達對細胞CAL27、Tca8113增殖的影響
圖1 miR-19-3p過表達對增殖相關(guān)蛋白表達的影響
2.3miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27凋亡的影響 與miR-NC組相比,miR-19-3p組CAL27細胞中miR-19-3p、Bax蛋白上調(diào),Bcl-2蛋白下調(diào),細胞凋亡率升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,圖3,表2。
圖2 miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27凋亡的影響
圖3 miR-19-3p過表達對Bax、Bcl-2表達的影響
表2 miR-19-3過表達對細胞CAL27凋亡的影響
2.4miR-19-3p過表達對CAL27遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比,miR-19-3p組CAL27細胞中E-cadherin蛋白表達顯著升高,MMP-2蛋白表達顯著降低,遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖4,圖5,表3。
圖4 miR-19-3p過表達對細胞CAL27遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)
圖5 miR-19-3p過表達對E-cadherin、MMP-2表達的影響
表3 miR-19-3p過表達對細胞CAL27遷移、侵襲的影響
2.5miR-19-3p靶向調(diào)控TC-1 miRcode在線預(yù)測網(wǎng)站顯示,miR-19-3p與TC-1之間存在互補的核苷酸序列(圖6)。與miR-NC組(1.12±0.08、1.08±0.09)相比,miR-19-3p組WT-TC-1細胞的熒光活性(0.35±0.02)明顯下調(diào)(t=22.872,P=0.000),MUT-TC-1(1.02±0.07)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.289,P=0.226);與miR-NC組相比,miR-19-3p組細胞TC-1 mRNA和蛋白均顯著下調(diào),與anti-miR-NC組相比,anti-miR-19-3p組細胞TC-1 mRNA和蛋白均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表4。
圖6 miR-19-3p靶向、調(diào)控TC-1
表4 miR-19-3p調(diào)控TC-1 mRNA、蛋白的表達
2.6過表達TC-1表達能逆轉(zhuǎn)miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與miR-NC組相比,miR-19-3p組CAL27細胞中TC-1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達均顯著降低,Bax、E-cadherin蛋白表達均顯著升高,24、48、72 h細胞活性均顯著下降,細胞凋亡率顯著上升,細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著下降(均P<0.05);與miR-19-3p +pcDNA3.1組相比,miR-19-3p +pcDNA3.1-TC-1組CAL27細胞TC-1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達均顯著上升,Bax、E-cadherin蛋白表達均顯著下降,24、48、72 h細胞活性均顯著上升,細胞凋亡率顯著下降,細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著上升(P<0.05)。見圖7、表5。
圖7 TC-1及凋亡、遷移蛋白的表達
表5 各組凋亡、侵襲蛋白表達及細胞活性、凋亡率、遷移、侵襲細胞數(shù)比較
miRNA是一類單鏈內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用〔6〕。miR-17-92簇是第一個被鑒定的致癌miRNA,也稱為oncomir-1,其基因組擴增和高表達在各種類型的癌癥中均有發(fā)現(xiàn),而miR-19是miR-17-92簇的關(guān)鍵成員,對促進腫瘤發(fā)生具有重要作用〔7~9〕。據(jù)報道,miR-19在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌等很多癌癥中均出現(xiàn)異常表達〔10,11〕。Christopher等〔12〕在研究中通過生物信息學(xué)方法篩選口腔鱗癌中與炎癥相關(guān)的miRNA發(fā)現(xiàn),miRNA-19a/b在調(diào)控口腔鱗癌的炎癥反應(yīng)中具有顯著影響,推測miRNA-19a/b的靶基因?qū)谇击[癌診斷和靶向治療有巨大潛力。本實驗發(fā)現(xiàn),miR-19-3p在口腔鱗癌組織中表達明顯下調(diào),這是國內(nèi)外首次明確miR-19-3p在口腔鱗癌中的異常表達,為miR-19-3p在口腔鱗癌中的研究及開發(fā)奠定基礎(chǔ);進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-19-3p抑制口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進其凋亡,這些結(jié)果均在研究miR-19-3p對口腔鱗癌的診斷和治療中的潛在價值奠定基礎(chǔ),也為后續(xù)進行miR-19-3p在其他癌癥中的功能及機制研究提供理論依據(jù);深入研究發(fā)現(xiàn),miR-19-3p可靶向負調(diào)控TC-1的表達,這說明miR-19-3p對口腔鱗癌細胞表型的調(diào)控功能與調(diào)控TC-1有關(guān),為miR-19-3p的調(diào)控機制研究提供依據(jù)。
TC-1是在2000年由澳大利亞學(xué)者Chua等〔13〕在研究甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)的一個新基因,后被命名為 C8orf4基因。近期,TC-1在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌中均出現(xiàn)表達異常升高〔14~17〕。白琳琳等〔18〕報道,TC-1在舌鱗癌組織中的過度表達與舌鱗癌的低分化程度相關(guān)。Zhang等〔19〕研究發(fā)現(xiàn),TC-1在舌鱗癌組織中的表達明顯升高,且與晚期TNM分期顯著相關(guān),其作用與調(diào)控Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路密切相關(guān),提示TC-1的高表達水平可能通過增強Wnt信號通路的活性來促進OTSCC的進展。本研究結(jié)果顯示,TC-1表達可受miR-19-3p的抑制,且過表達TC-1也可逆轉(zhuǎn)miR-19-3p的表達,這暗示TC-1在口腔鱗癌細胞中的表達上調(diào),為TC-1在口腔鱗癌中的功能研究奠定基礎(chǔ);進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達TC-1還可逆轉(zhuǎn)miR-19-3p對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關(guān)蛋白表達的調(diào)控作用,這說明TC-1不僅可逆向調(diào)控miR-19-3p在口腔鱗癌細胞中的表達,還可逆轉(zhuǎn)miR-19-3p對口腔鱗癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,為miR-19-3p在口腔鱗癌中的功能及機制研究提供依據(jù)。
綜上,miR-19-3p在口腔鱗癌中低表達,過表達miR-19-3p可抑制口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進凋亡,其機制與靶向TC-1相關(guān),為口腔鱗癌的靶向治療提供新靶點。