miR-519d-3p靶向KPNA2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制

胡德獻(xiàn) 孫衍昶 馮基高 莫業(yè)和

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 海口 570311)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中常見惡性腫瘤之一，其主要臨床病理特征為發(fā)病率高、死亡率高及惡性程度高，現(xiàn)有醫(yī)療水平尚不可有效治療膠質(zhì)瘤，治療后膠質(zhì)瘤患者生存期短預(yù)后差〔1〕。因而從分子水平上分析膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制對探尋新的診療方法及提高治療效果均具有重要現(xiàn)實(shí)意義。研究表明微小RNA(miR)-519d-3p(miR-519d-3p)在胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，miR-519d-3p過表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖〔2〕。miR-519d-3p過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔3〕。miR-519d-3p在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)表達(dá)后可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲〔4〕。然而，miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步明確miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的可能作用機(jī)制，通過靶基因預(yù)測軟件檢索發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α-2(KPNA2)可能是miR-519d-3p的靶基因，研究表明KPNA2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，敲除KPNA2后可顯著減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，但關(guān)于KPNA2上游調(diào)控miRNA等基因研究相對較少〔5〕。研究報(bào)道指出KPNA2在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中過表達(dá)，抑制KPNA2表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力〔6〕。沉默KPNA2表達(dá)能夠有效抑制膀胱癌細(xì)胞和舌鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力〔7,8〕。但miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，且miR-519d-3p是否通過調(diào)控KPNA2的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究分析miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，通過miR-519d-3p過表達(dá)分析其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，并驗(yàn)證miR-519d-3p是否可通過調(diào)控KPNA2表達(dá)而參與膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過程，以期為膠質(zhì)瘤靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 正常膠質(zhì)細(xì)胞株SVGp12購自美國ATCC，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87、T98G均購自上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞所。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；miR-519d-3p mimics及其陰性對照、miR-519d-3p抑制劑(anti-miR-519d-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒(si-KPNA2)及其陰性對照(si-NC)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Western印跡所用的二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國TIANGEN公司；兔抗人KPNA2多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自美國R&D Systems公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司；鼠抗人CyclinD1、p21、p27一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔與山羊抗鼠IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人MMP-2、MMP-9、MMP-14一抗均購自美國Santa Cruz公司；Trizol試劑與RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；pmiroGLO質(zhì)粒與雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)均購自美國Promega公司；Mgteigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自美國Bio-Rad公司；Transwell小室購自重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87、T98G與正常膠質(zhì)細(xì)胞株SVGp12復(fù)蘇后接種于含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，調(diào)整細(xì)胞濃度后將膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)將膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞隨機(jī)分為miR-NC組(U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染無關(guān)序列RNA)、miR-519d-3p組(U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics)，采用qRT-PCR法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后棄舊培養(yǎng)基并更換為含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。為驗(yàn)證miR-519d-3p與KPNA2的調(diào)控關(guān)系，將miR-519d-3p mimics、anti-miR-519d-3p及其各自陰性對照分別轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，即分別為miR-NC組、miR-519d-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-519d-3p組。為證實(shí)miR-519d-3p是否通過調(diào)控KPNA2表達(dá)而發(fā)揮作用，本研究設(shè)置共轉(zhuǎn)染組，分別為miR-519d-3p+pcDNA組(miR-519d-3p mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞)、miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2組(miR-519d-3p mimics與pcDNA-KPNA2共轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染條件與上述轉(zhuǎn)染相同，實(shí)驗(yàn)過程中均需嚴(yán)格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-519d-3p、KPNA2 mRNA表達(dá)水平 取膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、正常膠質(zhì)細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染后各組對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)，吸取5×106個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次×5 min，加入1 ml Trizol試劑，室溫放置5 min后加入200 μl氯仿，放入渦旋振蕩器振蕩30 s，4℃條件下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上清置于另一無菌無酶的1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇后放入渦旋振蕩器振蕩30 s，冰上放置5 min后，4℃條件下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌離心管底的RNA沉淀，洗滌2次，將離心管置于超凈工作臺(tái)晾干，加入20～40 μl DEPC水溶解(根據(jù)RNA量多少而定)，經(jīng)分光光度計(jì)測定RNA濃度，A260/A280在1.8～2.0之間為質(zhì)量較好。根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl：SYBR PCR Master mix 10 μl，正反向引物各0.4 μl，cDNA模板2 μl，無RNase水7.2 μl。反應(yīng)程序設(shè)定為95℃ 5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)樣本閾值Ct值，取3個(gè)復(fù)孔的平均值為該樣本Ct值，計(jì)算△Ct值(目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值)與△△Ct值(目的基因△Ct值與內(nèi)參基因△Ct值的差值)，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.3Western印跡檢測KPNA2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、正常膠質(zhì)細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染后各組對數(shù)生長期的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液(1 ml RIPA、1%PMSF、0.1%抑肽酶)提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，取蛋白樣本進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫下依次加入KPNA2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)，4℃條件下?lián)u晃孵育24 h，TBST洗滌3次，加入IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶3 000)，將一抗反應(yīng)膜放入二抗中，置于室溫下避光孵育1 h，滴加ECL顯影，暗室中曝光，凝膠分析系統(tǒng)及Quantity one軟件檢測條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) MTT檢測細(xì)胞增殖的主要原理為：活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶可促使MTT分解而產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀甲臜顆粒，其具有不溶于水的特性并可在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周圍沉積，藍(lán)色顆粒數(shù)量與細(xì)胞活力呈正比，而二甲基亞砜(DMSO)又可溶解藍(lán)色顆粒物，通過酶標(biāo)儀檢測OD值可確定細(xì)胞增殖速率。收集對數(shù)生長期膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，100 μl/孔，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，在轉(zhuǎn)染后第24、48、72小時(shí)各取一組細(xì)胞，每孔分別加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，分別在每孔加入150 μl的DMSO溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，選取波長為490 nm置于酶標(biāo)儀檢測各孔OD值。

1.2.5Transwell小室細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染后各組對數(shù)生長期膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入不含血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上層加入100 μl單細(xì)胞懸液，下室加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于溫度為37℃、5%CO2、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)8 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去微孔膜上層細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色5 min，置于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：無血清DMEM培養(yǎng)基與基質(zhì)膠以1∶8稀釋比進(jìn)行稀釋，將100 μl基質(zhì)膠稀釋液平鋪于Transwell小室底部的上室面，室溫放置6 h后，將100 μl單細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其余步驟與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，取平均值表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 應(yīng)用靶基因軟件預(yù)測miR-519d-3p的靶基因，發(fā)現(xiàn)KPNA2基因可能為miR-519d-3p潛在的靶基因。預(yù)測miR-519d-3p調(diào)控KPNA2基因的結(jié)合序列，設(shè)計(jì)合成KPNA2的3′UTR序列與突變后KPNA2的3′UTR序列，將合成的目的基因片段分別克隆入雙熒光素酶報(bào)告基因字啊提，構(gòu)建KPNA2的3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因野生型載體(WT-KPNA2)及其突變型載體(MUT-KPNA2)。用PCR電泳及基因測序等技術(shù)鑒定證明重組載體構(gòu)建成功。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別將WT-KPNA2、MUT-KPNA2與miR-519d-3p mimics或miR-519d-3p的陰性對照(NC)共轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，利用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測其熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-519d-3p和KPNA2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 與正常膠質(zhì)細(xì)胞株SVGp12比較，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87、T98G中miR-519d-3p的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而KPNA2 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，其中膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-519d-3p的表達(dá)水平較其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞株相對降低，而KPNA2 mRNA的表達(dá)水平相對升高，因此后續(xù)研究選用膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為研究細(xì)胞。相較于正常膠質(zhì)細(xì)胞株SVGp12，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87、T98G中KPNA2的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 KPNA2蛋白表達(dá)

表1 miR-519d-3p和KPNA2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的影響 轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-519d-3p的表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染陰性對照序列的miR-NC組(P<0.05)，提示成功升高膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-519d-3p的表達(dá)水平，見表2。轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h、72 h后OD值顯著高于miR-NC組(P<0.05)，表明miR-519d-3p過表達(dá)可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。相較于miR-NC組，miR-519d-3p組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，表明miR-519d-3p過表達(dá)可通過上調(diào)p21、p27蛋白表達(dá)及下調(diào)CyclinD1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，見圖2，表2。

圖2 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的影響

2.3miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移、侵襲的影響 miR-519d-3p組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)均顯著少于miR-NC組(P<0.05)，見表3，表明miR-519d-3p過表達(dá)可顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力。miR-519d-3p組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，見表3，圖3、圖4。表明miR-519d-3p過表達(dá)可通過下調(diào)MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲。

表3 miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移、侵襲的影響

圖3 兩組遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖4 miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251遷移、侵襲的影響(×200)

2.4抑制KPNA2表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染si-KPNA2的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中KPNA2的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖5、表4，提示成功降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中KPNA2的高表達(dá)。si-KPNA2組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性與si-NC組比較顯著降低(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)與si-NC組比較均顯著減少(P<0.05)，表明抑制KPNA2表達(dá)可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。與si-NC組比較，si-KPNA2組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而p21的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明抑制KPNA2表達(dá)可通過上調(diào)p21表達(dá)及下調(diào)CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。見圖5，表4。

圖5 KPNA2蛋白和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制KPNA2表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5miR-519d-3p靶向調(diào)控KPNA2的表達(dá) 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)KPNA2基因的3′UTR存在miR-519d-3p的結(jié)合位點(diǎn)，且結(jié)合穩(wěn)定性較好，其互補(bǔ)結(jié)合序列見圖6A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染克隆有KPNA2基因的3′UTR突變型載體質(zhì)粒(MUT-KPNA2)中，共轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics與轉(zhuǎn)染陰性對照(miR-NC)比較熒光素酶活性比較差異不顯著(P>0.05)；轉(zhuǎn)染克隆有KPNA2基因的3′UTR載體質(zhì)粒(WT-KPNA2)中，共轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics的熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染miR-NC的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表5。表明miR-519d-3p與KPNA2存在結(jié)合位點(diǎn)，并可調(diào)控KPNA2的活性。如圖6B所示，與miR-NC組(0.63±0.06)比較，miR-519d-3p組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中KPNA2的蛋白表達(dá)水平顯著降低(0.26±0.03，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.61±0.05)比較，anti-miR-519d-3p組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中KPNA2的蛋白表達(dá)水平顯著升高(0.92±0.09,P<0.05),表明miR-519d-3p可負(fù)向調(diào)控靶基因KPNA2的表達(dá)。

A:KPNA2的3′UTR中含有與miR-519d-3p互補(bǔ)的核苷酸序列；B：KPNA2蛋白表達(dá),1～4:miR-NC組、miR-519d-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-519d-3p組圖6 miR-519d-3p靶向調(diào)控KPNA2的表達(dá)

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6KPNA2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移和侵襲的作用 如圖7、表6所示，相較于miR-519d-3p+pcDNA組，miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞OD值顯著增加，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增多(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而p21的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。表明KPNA2過表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-519d-3p過表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

1～4:miR-NC組、miR-519d-3p組、miR-519d-3p+pcDNA組、miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2組圖7 KPNA2蛋白和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 KPNA2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-519d-3p過表達(dá)對U251增細(xì)胞殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

膠質(zhì)瘤具有浸潤性生長等特點(diǎn)，臨床常采用手術(shù)及放療或放療等手段進(jìn)行治療，但手術(shù)治療效果較差，因此深入探究膠質(zhì)瘤發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制對尋找新治療方法具有重要意義〔9〕。miR是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，其可調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞分化、增殖、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)過程〔10〕。miR可通過與靶基因的結(jié)合而抑制靶基因翻譯進(jìn)而抑制其表達(dá)，而靶基因又可調(diào)控細(xì)胞增殖及侵襲等生物學(xué)行為〔11〕。因此，深入探究miRNA及其靶基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制對研發(fā)膠質(zhì)瘤治療藥物具有重要指導(dǎo)意義。

miR-519d在喉鱗癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-519d表達(dá)可通過抑制轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔12〕。miR-519d在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低并可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲，提示上調(diào)miR-519d表達(dá)可能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲〔13〕。miR-519d表達(dá)水平升高可能通過抑制XIAP基因表達(dá)進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖最終抑制卵巢癌生長〔14〕。相關(guān)研究報(bào)道指出miR-519d-3p可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果說明miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用，U251細(xì)胞過表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。p21是CDK2抑制劑且可作為膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期相關(guān)的泛素-蛋白酶體通路靶蛋白，p27是細(xì)胞周期蛋白D-CDK4等的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過抑制CyclinD1蛋白表達(dá)及促進(jìn)p21、p27蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期停滯于G1期，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖〔16,17〕。本研究結(jié)果提示miR-519d-3p 過表達(dá)后可通過促進(jìn)p21、p27蛋白表達(dá)及抑制CyclinD1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。MMPs類是一種降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的酶，其中MMP-2、MMP-9、MMP-14是基質(zhì)金屬蛋白酶中的重要酶類，期可通過降解血管周圍基膜中層黏連蛋白及纖連蛋白等進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲〔18,19〕。本研究結(jié)果提示miR-519d-3過表達(dá)后可通過抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲。KPNA2位于人染色體17q23-q24，可參與細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)及細(xì)胞增殖凋亡等多種生理病理過程，近來研究發(fā)現(xiàn)KPNA2可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔20〕。乳腺癌細(xì)胞中KPNA2表達(dá)水平升高并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移，沉默KPNA2表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞增殖能力明顯降低〔21〕。表明KPNA2高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生及發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲低KPNA2表達(dá)可通過上調(diào)E-cadherin表達(dá)及下調(diào)Vimentin表達(dá)而抑制EMT轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲，同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明微小RNA-26b(microRNA-26b，miR-26b)可通過抑制KPNA2表達(dá)進(jìn)而抑制卵巢癌生長〔22〕。相關(guān)研究表明原發(fā)性腸癌組織中KPNA2的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，KPNA2高表達(dá)于結(jié)腸癌患者高分化程度、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈明顯正相關(guān)，并可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，同時(shí)在裸鼠移植瘤中敲低KPNA2表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖及克隆形成能力〔23〕。本研究結(jié)果說明抑制KPNA2表達(dá)可有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，同時(shí)本研究提示miR-519d-3p可通過抑制靶基因KPNA2表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，miR-519d-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，KPNA2表達(dá)上調(diào)，上調(diào)miR-519d-3p表達(dá)可通過靶向抑制KPNA2表達(dá)進(jìn)而減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，其可能作用機(jī)制與上調(diào)p21蛋白表達(dá)及下調(diào)CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)，miR-519d-3p可能作為治療膠質(zhì)瘤的潛在靶點(diǎn)。但miR-519d-3p在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)如何及其可能作用機(jī)制仍需深入研究。