miR-24-3p靶向HAP1基因?qū)TZ誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的影響

付莎莉 王莉 付阿丹 李娜

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430000)

胰島β細(xì)胞功能受損是引發(fā)2型糖尿病的主要因素，而細(xì)胞凋亡是促使胰島β細(xì)胞功能異常的重要原因，胰島β細(xì)胞凋亡可通過破壞胰島結(jié)構(gòu)及降低其功能進(jìn)而促使患者血糖升高〔1，2〕。因而探討胰島β細(xì)胞凋亡發(fā)生機制對有效提高2型糖尿病患者治療效果具有重要研究價值。研究表明1型和2型糖尿病患者的血漿中微小RNA(miR)-24水平升高〔3，4〕。在肥胖相關(guān)的糖尿病小鼠的胰島中miR-24的表達(dá)明顯高于對照組，過表達(dá)miR-24會導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能障礙并抑制胰島β細(xì)胞增殖〔5〕。然而，miR-24-3p在鏈尿佐菌(STZ)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)未見相關(guān)報道。通過靶基因預(yù)測軟件分析亨廷頓蛋白相關(guān)蛋白(HAP)1可能是miR-24-3p的靶基因，研究表明沉默 HAP1 表達(dá)可增加小鼠胰島β細(xì)胞株NIT細(xì)胞凋亡，同時也能促進(jìn)STZ誘導(dǎo)的胰島NIT 細(xì)胞的凋亡〔6〕。本研究擬探討miR-24-3p是否通過靶向調(diào)節(jié)HAP1表達(dá)影響STZ誘導(dǎo)的胰島NIT 細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1主要試劑 STZ購自美國Sigma公司；小鼠胰島β細(xì)胞系NIT購自上海通派生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；miR-24-3p mimic、miR-24-3p抑制劑(anti-miR-24-3p)及其對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1載體購自美國Invitrogen公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒購自上?；鄯f生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL3載體)購自上海漢恒生物科技有限公司；雙熒光報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；細(xì)胞裂解液購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；Annexin V/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國Life公司；HAP1 siRNA及si-NC均購自山東維真生物科技有限公司；HAP1抗體購自美國Sigma公司；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2與Bcl-2相關(guān)X抗體(Bax)抗體均購自美國Abcam公司；活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)-3抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白(Ig)G二抗購自美國Thermo公司。

1.2胰島β細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取出凍存胰島β細(xì)胞NIT，接種于6孔板(2×105個細(xì)胞/ml)，置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1 d更換為不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，分別將anti-miR-NC、anti-miR-24-3p、pcDNA 、pcDNA-HAP1轉(zhuǎn)染入NIT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換RPMI1640完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染過程均嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3胰島β細(xì)胞處理及分組 選取對數(shù)生長期NIT分為Con組、STZ組，其中Con組NIT細(xì)胞不進(jìn)行任何處理，STZ組NIT細(xì)胞中加入5 mmol/L STZ作用24 h〔7〕。收集轉(zhuǎn)染后12 h的NIT細(xì)胞，分別加入5 mmol/L STZ作用24 h，分別為STZ+anti-miR-NC組、STZ+anti-miR-24-3p組、STZ+pcDNA組、STZ+pcDNA-HAP1組。為了驗證HAP1與miR-24-3p在STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡過程中的作用，分別將si-NC、si-HAP1與anti-miR-24-3p共同轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞，12 h后分別加入5 mmol/L STZ作用24 h，分別為STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組、STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組。

1.4實時熒光定量(qRT)-PCR實驗 用Trizol法提取各組NIT細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA濃度與純度(1.8≤A260/A280≤2.0)，分別取2 μl RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR檢測miR-24-3p 、HAP1 mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)體系20 μl：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，50×ROX Reference 0.4 μl，ddH2O 補足至20 μl。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。根據(jù)PCR儀分析軟件計算miR-24-3p 、HAP1 mRNA相對表達(dá)量。

1.5Western印跡實驗 提取各組NIT細(xì)胞總蛋白，定量蛋白，以每孔30 μg蛋白樣加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)孔內(nèi)，將分離蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，采用脫脂奶粉封閉，2 h后分別加入HAP1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白一抗(1∶1 000)，4℃避光孵育，過夜，分別加入二抗(1∶5 000)，用電化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯影，曝光，置于凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶并應(yīng)用Quantity one軟件分析蛋白條帶灰度值，HAP1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3均以GAPDH為內(nèi)參基因。實驗均重復(fù)3次。

1.6雙熒光素酶報告實驗 收集對數(shù)生長期NIT細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別將野生型(WT)-HAP1、突變型(MUT)-HAP1與miR-NC、miR-24-3p mimic共轉(zhuǎn)染，24 h后利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測細(xì)胞熒光素酶活性，棄各孔培養(yǎng)基，分別加入細(xì)胞裂解液，搖床振蕩1 h后分別收集細(xì)胞裂解液，置于離心機離心1 min(1 200 r/ min轉(zhuǎn)速)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，嚴(yán)格按照熒光素酶檢測試劑盒說明書操作并檢測細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.7流式細(xì)胞術(shù)實驗 取1.3中各組NIT細(xì)胞，胰蛋白酶消化，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次分別加入5 μl Annexin V-異硫氰酸FITC、PI，混勻后室溫避光孵育5 min，置于流式細(xì)胞儀檢測各組NIT細(xì)胞凋亡率。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1STZ對胰島β細(xì)胞中miR-24-3p和HAP1表達(dá)的影響 STZ組胰島β細(xì)胞中miR-24-3p相對表達(dá)量相較于Con組明顯升高(P<0.001)，而HAP1 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.001)，見圖1、表1。表明STZ可促使胰島β細(xì)胞中miR-24-3p表達(dá)上調(diào)，HAP1表達(dá)下調(diào)，由此推測miR-24-3p與HAP1可能存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系。

圖1 HAP1蛋白表達(dá)

表1 STZ對胰島β細(xì)胞中miR-24-3p和HAP1表達(dá)的影響

2.2miR-24-3p靶向調(diào)控HAP1的表達(dá) HAP1可能為miR-24-3p的靶基因，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗驗證miR-24-3p與HAP1的靶向關(guān)系，miR-24-3p mimic與WT-HAP1基因3′非翻譯區(qū)(UTR)報告基因載體共轉(zhuǎn)染時，胰島β細(xì)胞NIT的熒光素酶活性明顯被抑制(P<0.001)，而miR-24-3p mimic與WT-HAP1基因3′UTR報告基因載體共轉(zhuǎn)染時，NIT細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表2。在NIT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimic后，miR-24-3p組HAP1蛋白(0.16±0.03)顯著低于miR-NC組(0.57±0.05，P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-24-3p抑制劑后anti-miR-24-3p組HAP1蛋白(0.89±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.58±0.05，P<0.05)，見圖2B。表明HAP1是miR-24-3p的靶基因，miR-24-3p可負(fù)向調(diào)控靶基因HAP1表達(dá)。

A：HAP1的3′UTR中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列；B：HAP1蛋白表達(dá)圖2 miR-24-3p靶向調(diào)控HAP1的表達(dá)

表2 雙熒光素酶報告實驗

2.3抑制miR-24-3p表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響 STZ組NIT細(xì)胞凋亡率明顯高于Con組(P<0.05)，表明STZ可促使胰島β細(xì)胞凋亡。與STZ+anti-miR-NC組相比，STZ+anti-miR-24-3p組NIT細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖3、圖4、表3。表明STZ可能通過上調(diào)miR-24-3p表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡。

1～4：Con組、STZ組、STZ+anti-miR-NC組、STZ-anti-miR-24-3p；圖5同圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

圖4 抑制miR-24-3p表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響

表3 抑制miR-24-3p表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響

2.4HAP1過表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響 與STZ+pcDNA組相比，STZ+pcDNA-HAP1組NIT細(xì)胞中HAP1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，提示HAP1過表達(dá)NIT細(xì)胞株構(gòu)建成功。相較于STZ+pcDNA組，STZ+pcDNA-HAP1組NIT細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見表4、圖5。表明HAP1過表達(dá)可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)并促使Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)進(jìn)而抑制STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。

表4 HAP1過表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響

圖5 HAP1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5抑制HAP1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-24-3p表達(dá) 對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的作用 STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組NIT細(xì)胞中HAP1蛋白表達(dá)明顯低于STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組(P<0.05)，表明抑制miR-24-3p表達(dá)可拮抗STZ對HAP1蛋白表達(dá)的抑制作用。與STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組相比，STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組NIT細(xì)胞凋亡率及Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表5、圖6。表明抑制HAP1表達(dá)可提高STZ對miR-24-3p表達(dá)的促進(jìn)作用進(jìn)而促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡。

表5 抑制HAP1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-24-3p表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的作用

1～4：STZ+anti-miR-NC組、STZ+anti-miR-24-3p組、STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組、STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組圖6 HAP1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能紊亂均為2型糖尿病發(fā)病機制，而胰島β細(xì)胞凋亡可促使其功能紊亂，同時還可促使胰島素細(xì)胞數(shù)量減少〔8，9〕。因而保護(hù)胰島β細(xì)胞及避免其細(xì)胞凋亡是治療2型糖尿病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。miR具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡的作用，研究表明miR表達(dá)異常與胰島β細(xì)胞凋亡有關(guān)〔10〕。miR-24可通過抑制Neurodl蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制小鼠胰島β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞數(shù)量及胰島素分泌〔11〕。研究表明，miR-24可通過抑制細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(Cdk)4、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D3 蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制胰島β細(xì)胞增殖，Cdk4、CyclinD3 過表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，但關(guān)于其具體作用機制仍需探究〔12，13〕。1型與2型糖尿病患者血清中miR-24-3p表達(dá)上調(diào)并可參與疾病進(jìn)展過程〔14，15〕。胰島β細(xì)胞凋亡的主要途徑為線粒體凋亡途徑，Bax與Bcl-2異常表達(dá)可增加線粒體外膜通透性進(jìn)而促使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞外，細(xì)胞色素C又可激活caspase-3等進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡〔16，17〕。提示抑制miR-24-3p表達(dá)可通過降低Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)而上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制線粒體凋亡途徑最終抑制胰島β細(xì)胞凋亡。

HAP1可廣泛分布于機體甲狀腺、胰島等組織器官，研究顯示，HAP1可在胰島β細(xì)胞及大鼠β細(xì)胞瘤細(xì)胞系中特異性表達(dá)，HAP1表達(dá)異?？捎绊懸葝uβ細(xì)胞分泌胰島素的功能〔18，19〕。研究發(fā)現(xiàn)，HAP1可通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元〔20〕。但HAP1是否也可通過抑制胰島β細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用仍未可知。本研究說明HAP1表達(dá)降低可能促使胰島β細(xì)胞凋亡，HAP1過表達(dá)可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)并促使Bcl-2/Bax比例失衡導(dǎo)致線粒體凋亡途徑失活進(jìn)而對胰島β細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用。抑制HAP1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-24-3p表達(dá)對STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的作用。提示miR-24-3p可直接靶向調(diào)控HAP1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡。