PDCD5蛋白基于順鉑為基礎(chǔ)的非小細胞肺癌化療敏感性

李晶 蘇帆 林芷伊 費晶 徐丹 鞏平

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆 石河子 832000；2萊西市人民醫(yī)院)

在世界范圍內(nèi)肺癌生存率僅為15%〔1〕。非小細胞肺癌(NSCLC)作為癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，約占所有肺癌病例的80%〔2〕。順鉑是一種鉑合成復(fù)合物，被廣泛用作NSCLC治療的一線化療藥物〔3〕。但是，重復(fù)化療使一些腫瘤產(chǎn)生了耐藥性，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)和預(yù)后不良，這使得順鉑的臨床療效受到嚴重限制〔4〕。因此，發(fā)現(xiàn)無嚴重不良反應(yīng)的新方法改善化療、減少化療耐受具有重要意義〔5，6〕。腫瘤的發(fā)病機制與細胞凋亡密切相關(guān)。從人紅系白血病細胞(TF-1)發(fā)生凋亡時克隆而來的TF-1 apoptosis-related基因(TFAR)19，在細胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。在TFAR19被國際人類基因提名委員會(加入基因庫號：AF014955)指定為程序性細胞死亡因子(PDCD)5之前，首先被Liu等〔7〕于1999年在北京大學(xué)人類疾病基因組學(xué)中心報道。PDCD5在包括肺癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中表達都降低〔8〕。重組人PDCD5 (rhPDCD5)蛋白通過網(wǎng)格蛋白獨立的內(nèi)吞作用進入細胞，促進細胞凋亡活性〔9〕。這說明rhPDCD5不僅使軟骨肉瘤〔10〕、肝癌細胞對順鉑化療敏感〔11〕，而且還使K562細胞對去甲氧柔紅霉素(IDR)和阿糖胞苷(Ara-C)化療敏感。本研究觀察rhPDCD5對肺癌細胞對順鉑的化療敏感性的影響，為提高順鉑的抗腫瘤效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 順鉑購自濟南齊魯藥業(yè)公司(中國濟南)，并根據(jù)需要在無菌鹽水中制備新鮮稀釋液。rhPDCD5蛋白由北京生物海洋技術(shù)有限公司(中國北京)提供。PDCD5蛋白的內(nèi)毒素活性超過10 EU/mg，使用鱟變形細胞裂解液檢測，純度為95%〔12〕。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Usen Science Inc.(中國武漢)；人肺腺癌細胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院細胞庫(中國上海)。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 A549細胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清(BSA)、青鏈霉素混合液(100×)的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3ELISA檢測PDCD5細胞中蛋白水平 細胞在6孔板(每孔4×104個細胞)中生長24 h，然后用順鉑(順鉑組)、順鉑+rhPDCD5 15 μg/ml(rhPOCD5A組)、順鉑+rhPDCD5 30 μg/ml(rhPDCD5 B組)處理，將磷酸鹽緩沖液(PBS)用作對照組。處理24 h后，用胰蛋白酶分離貼壁細胞，然后通過離心收集。然后將細胞在冷PBS中洗滌3次。將重懸的PBS(1×)細胞進行超聲波處理4次，在4℃下1 500 r/min離心10 min。向每個孔中加入100 μl樣品，將細胞在37℃下溫育2 h。在抽吸和添加100 μl制備的檢測試劑A之前，在37℃下進行第2次溫育1 h。然后吸出并洗滌3次。再加入制備的100 μl檢測試劑B，在37℃下孵育30 min，然后吸出并洗滌5次。隨后加入90 μl底物溶液，在37℃下孵育25 min。最后，添加50 μl終止液并立即用酶標儀讀取450 nm波長處OD值。每次處理均重復(fù)3次。

1.4MTT比色法檢測增殖 采用MTT法測定細胞增殖。細胞生長在96孔板(2×103個細胞)24 h，加藥同1.3，加藥后12 h、24 h、36 h分別檢測細胞增殖抑制率，加入5 mg/ml MTT試劑20 μl，置于暗處培養(yǎng)4 h。酶標儀在490 nm參比(BioRad Lab Technologies，USA)的波長下測量平板的吸光度。結(jié)果表示為相對于未處理對照的吸光度百分比，每次處理均重復(fù)3次。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將A549細胞接種在6孔板(4×105個細胞)中培養(yǎng)24 h。細胞經(jīng)順鉑和(或)rhPDCD5處理并培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶分離黏附細胞，離心收集。然后將細胞在冷PBS中洗滌3次，再懸浮在100 ml的結(jié)合緩沖液中。根據(jù)說明書(中國杭州聯(lián)科生物)添加FITC耦聯(lián)的AnnexinV和碘化丙啶(PI)。暗處室溫下處理20 min，加入400 ml結(jié)合緩沖液。立即在流式細胞儀(FACSAria，Becton Dickinson，USA)上對樣品進行分析。實驗結(jié)果重復(fù)3次。

1.6樣本 本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科倫理委員會批準，參與者均簽署書面知情同意書。招募了2013年1月至2014年1月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的NSCLC患者。收集肺癌患者外周血標本(男13例，女27例，年齡30～79歲，中位年齡60.5歲)。使用中位數(shù)將患者分為PDCD5高表達組和PDCD5低表達組，給予鉑類藥物與其他化療藥物用于化療。治療周期為21 d，包括4個周期。樣本采集前患者均未接受化療、放療、手術(shù)治療或生物治療?；颊叩脑\斷均為活檢所證實。治療前影像學(xué)研究，采用美國癌癥分期系統(tǒng)聯(lián)合委員會〔13〕進行組織學(xué)分級，臨床分期按照TNM標準〔14〕進行。將樣本凝結(jié)30 min，然后離心10 min，將所有樣本冷凍儲存在-80℃，直到試驗。

1.7ELISA法檢測血清PDCD5蛋白表達 用ELISA試劑盒測定患者血清中PDCD5蛋白的表達。設(shè)立空白孔、標準品孔和樣本反應(yīng)孔。以標準品稀釋溶液作為空白。37℃下培養(yǎng)2 h，然后抽吸和添加100 μl制備的檢測試劑A并在37℃溫育1 h，將其吸出并洗滌3次。接下來加入100 μl制備的檢測試劑B并在37℃下溫育30 min，然后吸出并洗滌5次。隨后加入90 μl底物溶液，在37℃溫育25 min。最后，添加50 μl終止液，立即讀取450 nm波長處的OD值。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、Pearson分析、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的PDCD5蛋白處理后A549細胞中PDCD5蛋白表達上調(diào) 隨著rhPDCD5蛋白濃度的增加，PDCD5蛋白表達在A549細胞中表達上調(diào)，對照組、順鉑組、rhPDCD5 A組、rhPDCD5 B組PDCD5蛋白表達分別為：(0.269±0.000)pg/ml、(0.111±0.002)pg/ml、(0.123±0.009)pg/ml、(0.157±0.009)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=284.321，P<0.001)。

2.2rhPDCD5增強順鉑誘導(dǎo)的A549細胞生長停滯 與順鉑組相比，rhPDCD5 A組和B組增殖抑制率顯著更高，且這種效應(yīng)呈劑量和時間依賴性。見表1。

表1 rhPDCD5增強順鉑誘導(dǎo)的A549細胞的增殖抑制率

2.3順鉑處理后rhPDCD5蛋白促進A549細胞凋亡 各組細胞凋亡率分別為：對照組(6.56±0.49)%，順鉑組(22.31±0.64)%，rhPDCD5 A組(43.30±0.62)%，rhPDCD5 B組(64.25±0.54)%，各組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 908.87，P<0.001)。不同劑量PDCD5(15和30 μg/ml)與順鉑聯(lián)合應(yīng)用細胞凋亡率協(xié)同增加，并且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 rhPDCD5促進順鉑誘導(dǎo)的A549細胞凋亡

2.4PDCD5蛋白存在于NSCLC患者中 PDCD5蛋白表達與年齡或性別無顯著相關(guān)性，但與吸煙、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

2.5rhPDCD5蛋白增強了NSCLC患者順鉑的抗腫瘤活性 對于鉑類化療藥物，較高的表達效率為80%(16/20)，而較低的表達效率為45%(9/20)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 根據(jù)臨床病理學(xué)特征和小細胞肺癌患者的治療效果的PDCD5蛋白的表達(n)

3 討 論

NSCLC治療方案的選擇取決于疾病的階段、表現(xiàn)狀態(tài)。對于晚期患者來說，化療可能是唯一可選的治療方式。盡管對順鉑耐藥性的改善是NSCLC患者長期治療需要克服的重要的障礙〔4〕，順鉑仍是NSCLC患者最有效的治療方法之一，增強NSCLC細胞對順鉑敏感性的因素可能會突出治療的預(yù)測性生物標志物或靶點。

PDCD5在細胞凋亡和細胞周期中起重要作用。據(jù)報道〔14〕，健康肺組織中的PDCD5蛋白表達量高于肺癌組織。研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5過表達可誘導(dǎo)肺癌細胞系A(chǔ)549凋亡〔15〕。此外，在培養(yǎng)基中加入外源性rhPDCD5可以增強由硫酸肝素蛋白多糖結(jié)合和脂筏引發(fā)的網(wǎng)格蛋白獨立內(nèi)吞通路引起的程序性細胞死亡〔9〕。在本研究中，外源性添加不同濃度的rhPDCD5到A549培養(yǎng)基中，可以增加PDCD5蛋白的表達。本研究發(fā)現(xiàn)PDCD5蛋白可以改變腫瘤的生物學(xué)行為，提高A549細胞對順鉑的體外敏感性。有報道稱PDCD5基因和PDCD5蛋白可增強胃癌細胞〔16〕、骨肉瘤細胞〔17〕、軟骨肉瘤細胞〔10〕、乳腺癌細胞〔18〕、慢性粒細胞白血病細胞〔19〕、膠質(zhì)瘤細胞〔20〕、肝癌細胞〔21〕對化療的敏感性等。

本研究中，PDCD5蛋白在NSCLC中的表達降低與年齡、性別無關(guān)，與吸煙行為、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有報道稱PDCD5表達與年齡、性別無顯著關(guān)系，但與人胃腸道間質(zhì)瘤患者的腫瘤大小及有絲分裂有顯著相關(guān)性〔22〕。在肝癌患者中，PDCD5的表達與乙肝病毒(HBV)感染、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存時間有顯著相關(guān)性〔23〕。Xu等〔24〕在喉癌鱗狀細胞癌中的報道表明，PDCD5的表達與年齡、性別、原發(fā)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部位無顯著相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)PDCD5蛋白低表達與不良療效呈正相關(guān)。事實上，在膠質(zhì)瘤〔25〕、前列腺癌〔26〕、上皮性卵巢癌〔27〕、軟骨肉瘤〔28〕患者中，PDCD5低表達與預(yù)后不良呈正相關(guān)。由于后續(xù)治療的差異，僅觀察到4個化療周期后的療效。

綜上所述，本研究首次證實rhPDCD5對順鉑誘導(dǎo)的細胞毒性具有明顯的致敏作用。高表達PDCD5蛋白的肺癌患者可能更適合采用以順鉑為基礎(chǔ)的化療。PDCD5有可能用于改善肺癌患者對順鉑化療的反應(yīng)，但尚需進一步的研究證實。