阿托伐他汀鈣對(duì)冠心病患者外周血炎癥因子及單核細(xì)胞極化的影響

魯琦 李論

(武漢市第四醫(yī)院 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430033)

冠心病是指冠狀動(dòng)脈在粥樣硬化的基礎(chǔ)上發(fā)生管腔狹窄或閉塞，從而導(dǎo)致心肌缺血缺氧甚至壞死的心臟疾病〔1〕。據(jù)推算，我國(guó)冠心病現(xiàn)患人數(shù)已達(dá)1 100萬(wàn)例，其中心臟病死亡率為144.79/10萬(wàn)，且呈逐年上升階段〔2，3〕。目前，冠心病的主要治療方式為藥物治療。阿托伐他汀鈣作為他汀類降脂藥物已逐漸廣泛應(yīng)用于冠心病的治療。本研究擬探討阿托伐他汀鈣對(duì)冠心病的治療效果及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年6月至2018年6月在武漢市第四醫(yī)院心內(nèi)科診治的冠心病患者110例按隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組及干預(yù)組各55例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)、美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)診斷標(biāo)準(zhǔn)：左冠狀動(dòng)脈主干(LM)、左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠狀動(dòng)脈(RCA)中至少一支冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥50%；心功能Ⅰ、Ⅱ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病前2個(gè)月內(nèi)服用過(guò)他汀類藥物；合并自身免疫性疾病或惡性腫瘤；合并嚴(yán)重肺部、肝腎功能不全；合并急慢性感染；近3個(gè)月內(nèi)有外傷或手術(shù)史。入院時(shí)詳細(xì)收集各組臨床資料及輔助檢查結(jié)果。本研究經(jīng)武漢市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。兩組年齡、性別、吸煙史、體重指數(shù)(BMI)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高血壓發(fā)生率、糖尿病發(fā)生率及冠狀動(dòng)脈病變累及支數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2主要試劑 人腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，人高遷移率族蛋白(HMG)B1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本世諾有限公司，人單核細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自天津市灝洋生物制品有限公司，胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol裂解液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞及免疫沉淀(IP)裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，精氨酸酶(Arg)-1及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3方法 對(duì)照組給予傳統(tǒng)治療方案：阿司匹林腸溶片(廠家：Bayer S.p.A.有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130078)，100 mg/次，1次/d，口服；及單硝酸異山梨酯片(廠家：阿斯利康制藥有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030417)，30 mg/次，1次/d，口服。連續(xù)用藥2個(gè)月。干預(yù)組在傳統(tǒng)治療方案的基礎(chǔ)上加用阿托伐他汀鈣片(廠家：輝瑞制藥有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20030048)，20 mg/次，1次/晚，口服。連續(xù)服藥2個(gè)月。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1療效評(píng)價(jià) 根據(jù)患者心絞痛癥狀發(fā)作情況評(píng)估治療效果：顯效為治療后心絞痛發(fā)作頻次降低≥80%；有效為治療后心絞痛發(fā)作頻次降低程度介于50%～79%；無(wú)效為治療后心絞痛發(fā)作頻次降低<50%〔4〕。顯效率+有效率=總有效率。

1.4.2血清中TNF-α、HMGB1水平檢測(cè) 于服藥前及服藥2個(gè)月后，所有患者空腹抽取外周血，室溫、4 000 r/min離心獲取血清，于-80℃儲(chǔ)存。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)血清中TNF-α及HMGB1水平。

1.4.3外周血單核細(xì)胞提取 于服藥前及服藥2個(gè)月后，所有患者空腹抽取外周血，將血液標(biāo)本與磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋混勻，將混合液輕輕置于分離液上，于3 000 r/min、4℃條件下離心30 min。離心后出現(xiàn)分層，取第二層白膜細(xì)胞，PBS洗滌，獲取單核細(xì)胞備用。

1.4.4RT-q-PCR法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中iNOS、Arg-1 mRNA的表達(dá) 取1×106個(gè)單核細(xì)胞，加入1 ml Trizol，提取總RNA，測(cè)定RNA濃度及D260/D280；按照TaKaRa RR047A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再按照TaKaRa RR820A進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分別計(jì)算iNOS、Arg-1 mRNA的表達(dá)量。具體引物序列如下：iNOS上游：5′-GGAGCCAGCTCTGCATTATC-3′，下游：5′-TTTTGTCTCCAAGGGACCAG-3′；Arg-1上游：5′-CCCCAGTACCAACAGGACTACC-3′，下游：5′-TGAACGTGGCGGAATTTTGT-3′； GAPDH上游：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.4.5Western印跡法檢測(cè)iNOS及Arg-1的蛋白表達(dá) 取1×106個(gè)單核細(xì)胞，用細(xì)胞及IP裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備蛋白樣品，80 V恒定電壓電泳30 min后調(diào)節(jié)為120 V繼續(xù)電泳90 min，切膠、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗過(guò)夜，TBST洗滌后二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光顯色，BioRad系統(tǒng)曝光，Quantity one分析圖片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療后療效比較 干預(yù)組的總體有效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組療效比較〔n=55,n(%)〕

2.2兩組治療前后血清HMGB1及TNF-α及蛋白水平比較 治療前，兩組血清中HMGB1及TNF-α水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，兩組HMGB1及TNF-α水平均顯著下降(P<0.05)。同時(shí)，治療后干預(yù)組HMGB1及TNF-α水平均明顯低于對(duì)照組(P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 兩組治療前后血清HMGB1及TNF-α水平比較

2.3兩組治療前后外周血單核細(xì)胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白水平比較 兩組治療前，外周血單核細(xì)胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，兩組iNOS mRNA及蛋白水平顯著下降，Arg-1 mRNA及蛋白水平顯著升高(均P<0.05)。治療后干預(yù)組iNOS mRNA及蛋白水平明顯低于對(duì)照組，干預(yù)組Arg-1 mRNA及蛋白水平明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表4，圖1。

表4 兩組治療前后外周血單核細(xì)胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平比較

1～4：對(duì)照組治療前，干預(yù)組治療前，對(duì)照組治療后，干預(yù)組治療后圖1 兩組治療前后外周血單核細(xì)胞中iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明，炎癥反應(yīng)在冠心病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。李志等〔5〕發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，冠心病患者血清中白細(xì)胞介素(IL)-8水平明顯增高，而IL-10水平則顯著降低，且炎癥因子的表達(dá)與冠心病危險(xiǎn)程度呈正相關(guān)，提示炎癥反應(yīng)在冠心病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者血清中炎癥因子IL-6及TNF-α水平顯著增高，炎癥反應(yīng)與病情程度密切相關(guān)，在病情評(píng)估上具有一定應(yīng)用價(jià)值〔6〕。因此，抑制炎癥反應(yīng)則可能改善冠心病的病情，延緩疾病進(jìn)展。

阿托伐他汀鈣除具有調(diào)脂作用外，其還具有抗炎、改善血管內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌增殖、防止血栓形成及穩(wěn)定斑塊等作用〔7，8〕。對(duì)于急性腦梗死患者，阿托伐他汀可明顯降低血清中炎癥因子IL-6、內(nèi)皮素及單核細(xì)胞趨化因子1〔9〕。阿托伐他汀還可明顯調(diào)節(jié)冠心病患者血脂水平、降低血清超敏C反應(yīng)蛋白及改善左室射血分?jǐn)?shù)，從而有助于延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程〔10〕。而Zhao等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性高血壓大鼠中，阿托伐他汀可明顯降低血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，改善腎臟病理?yè)p害，其抗炎機(jī)制可能與增加過(guò)氧化物酶體增殖激活受體-γ的表達(dá)有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀在冠心病上也具有良好的抗炎作用。

單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是人體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)記物的不同，可將其分為經(jīng)典活化的單核-巨噬細(xì)胞(M1型)及選擇性活化的單核-巨噬細(xì)胞(M2型)〔12〕。單核-巨噬細(xì)胞極化在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用〔13〕。在心肌梗死早期，心臟局部的巨噬細(xì)胞主要分化為M1型，可分泌大量炎癥因子從而介導(dǎo)心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；而在后期，巨噬細(xì)胞則向M2型轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)梗死心肌的修復(fù)重塑〔14〕。研究表明，巨噬細(xì)胞極化還可參與維持冠脈中斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌大量炎癥因子，使得斑塊內(nèi)環(huán)境中基質(zhì)金屬蛋白酶水平上升，后者可促進(jìn)斑塊周圍纖維基質(zhì)的水解，從而降低斑塊穩(wěn)定性；而具有抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞則可抑制上述炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而維持斑塊穩(wěn)定性〔15〕。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M1/M2極化可作為冠心病防治的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

綜上，阿托伐他汀對(duì)冠心病有治療作用，其可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞呈M2型極化，從而發(fā)揮抗炎作用，提高治療效果。