一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定

蘇金鳳，呂祥，馬傳敏，楊樹林

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東泰安 271016）

在環(huán)境中，氨氮循環(huán)主要依靠具有硝化能力的微生物實(shí)現(xiàn)。硝化能力是氧化氨氮為亞硝酸鹽以及氧化亞硝酸鹽為硝酸鹽的能力。第一階段為亞硝化，即銨根（NH4+）氧化為亞硝酸根（NO2-）的階段，主要依托具有氨氧化酶活性的微生物實(shí)現(xiàn)；第二階段為硝化，即亞硝酸根（NO2-）氧化為硝酸根（NO3-）的階段，主要依托具有亞硝酸根氧化酶活性的微生物實(shí)現(xiàn)。氨氧化作用是硝化過程的限速步驟，被普遍認(rèn)為由亞硝化細(xì)菌獨(dú)立承擔(dān)，通過氨單加氧酶和羥胺氧化還原酶活性實(shí)現(xiàn)其亞硝化過程。該類細(xì)菌屬于需氧化能自養(yǎng)型細(xì)菌，其生化活性受到環(huán)境因素和微生物生態(tài)特征影響[1]。所以不同氣候和生態(tài)地區(qū)，該類細(xì)菌的生態(tài)作用各異。同時(shí)，環(huán)境中還包含眾多具有硝化能力的微生物，在環(huán)境氨氮循環(huán)過程中發(fā)揮作用。本研究通過對(duì)奈河水系中具有硝化能力的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，尋找適應(yīng)本地環(huán)境的具有硝化能力的細(xì)菌。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：A型改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基，招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；普通營養(yǎng)培養(yǎng)基，濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司；Griess reagent格里斯試劑，Sigma-Aldrich；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

儀器：microlab 300型半自動(dòng)生化分析儀，荷蘭威圖公司；HX-21合肥恒星快速細(xì)菌鑒定分析儀，合肥恒星科技開發(fā)有限公司。

1.2 樣本采集與處理

選取泰安市泰山區(qū)奈河水系城區(qū)段采集水樣。無菌采集水樣500 mL，4 ℃冷藏運(yùn)送，2 h內(nèi)完成接種。使用0.22 μm無菌水系濾膜抽濾后，將濃集后濾膜接種于改良斯蒂芬遜A型液體培養(yǎng)基中選擇性增菌培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的增菌培養(yǎng)

將接種了細(xì)菌的改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型液體培養(yǎng)基避光28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d。

1.3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

取增菌培養(yǎng)物，以三區(qū)劃線方式接種于改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型固體培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)5 d。

1.3.3 細(xì)菌的純培養(yǎng)與保存

取分離培養(yǎng)獲得的單個(gè)菌落，分別以三區(qū)劃線方式接種于兩個(gè)改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型固體培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板上，相同培養(yǎng)基的兩塊平板分別置于28 ℃和37 ℃避光培養(yǎng)5 d。將純培養(yǎng)物以載體保藏法的方式保存。

1.3.4 硝化能力的測(cè)定

將純培養(yǎng)菌株接種于改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型液體培養(yǎng)基中，28 ℃避光振蕩培養(yǎng)5 d。取培養(yǎng)后液體培養(yǎng)基，離心取上清1 000 μL，加入格里斯試劑20 μL，90 ℃水浴2 min，檢測(cè)524 nm處吸光值。使用半自動(dòng)生化分析儀，以0.5 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白試劑為標(biāo)準(zhǔn)，一點(diǎn)校正并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過樣品吸光值獲得其亞硝酸鹽含量。

1.3.5 細(xì)菌核酸提取與測(cè)序

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA；PCR擴(kuò)增使用16SrDNA基因通用引物27F（5′－AGAGTTTGATCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）。擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用BLAST＿W與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.6 生化鑒定

依據(jù)測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果，以及革蘭染色和氧化酶試驗(yàn)結(jié)果，使用HX-21細(xì)菌鑒定分析系統(tǒng)對(duì)分離菌株進(jìn)行生化鑒定及結(jié)果報(bào)告。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化能力檢測(cè)分析

通過選擇性增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)以及純培養(yǎng)，所采集樣品中共分離培養(yǎng)出4株菌落形態(tài)不同的菌株。通過硝化能力篩選，發(fā)現(xiàn)其中一株細(xì)菌具有硝化能力。

檢測(cè)對(duì)象分為水空白組、試劑空白組（未接種細(xì)菌的改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型液體培養(yǎng)基，并且與試驗(yàn)組同時(shí)培養(yǎng)）和試驗(yàn)組（接種菌株的改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型液體培養(yǎng)基，并完成培養(yǎng)）。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。數(shù)據(jù)顯示，空白對(duì)照與試劑空白培養(yǎng)前后亞硝酸鹽濃度無明顯變化。與試劑空白相比，所分離的4號(hào)菌株能夠完成亞硝化過程，具有明顯的硝化能力。

圖1 分離菌株硝化能力統(tǒng)計(jì)圖

2.2 16SrDNA分析

通過測(cè)序，獲得4號(hào)菌株16SrDNA有效長度為1 477 bp。測(cè)序結(jié)果使用BLAST＿W與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫中的Flavobacterium sp. WB2.1-16有98.15%的同源性；與數(shù)據(jù)庫中的Flavobacterium sp. UMI-01有97.35%的同源性；與數(shù)據(jù)庫中的Flavobacterium sp. WB2.1-19有97.40%的同源性。其系統(tǒng)發(fā)育樹圖見圖2。所以，可以確定4號(hào)菌株屬于黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）細(xì)菌。

圖2 4號(hào)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.3 生化鑒定結(jié)果

4號(hào)菌株在改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型固體培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂平板上均可生長，28 ℃生長良好，37 ℃生長不良；血瓊脂平板生長不良，無溶血現(xiàn)象。光滑型菌落，有脂溶性黃色色素，菌落不易挑起；革蘭染色陰性桿菌，2～3 μm長，菌體較細(xì)，直或彎曲，單個(gè)散在分布，見圖3；氧化酶試驗(yàn)陽性。

根據(jù)核酸測(cè)序與比對(duì)結(jié)果以及以上生物學(xué)特性，選擇HX-21細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的非發(fā)酵鑒定板，其結(jié)果見表1。通過與鑒定數(shù)據(jù)庫比對(duì)，4號(hào)菌株屬于金黃桿菌Ⅱb菌種，概率為99%。

圖3 4號(hào)菌株形態(tài)

環(huán)境中的氮素分為有機(jī)氮和無機(jī)氮，且以無機(jī)氮為主。氮素輸出有多種方式，其中與植物吸收利用密切相關(guān)的是硝態(tài)氮中的硝酸根。自然環(huán)境中，氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸根的過程被普遍認(rèn)為由微生物完成，其中包括亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌以及非硝化細(xì)菌但具有硝化能力的其他微生物。近年來，異養(yǎng)型具有硝化能力的細(xì)菌被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。唐偉等[2]2019年報(bào)道了6株具有異養(yǎng)硝化作用的細(xì)菌，其中一株對(duì)NH4+-N 去除率為75.67%，經(jīng)16SrDNA測(cè)序鑒定，菌株HNM-4為假單胞菌（Pseudomonas sp.）。邰勇等[3]2019年報(bào)道了一株農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium sp.）的異養(yǎng)硝化菌BT1，該菌株具有高效的異養(yǎng)硝化性能及優(yōu)異的氨氮耐受性，在高氨氮濃度（500 mg/L和1 000 mg/L）下生長良好且NH4+-N去除率均超過64.69%。楊壘等[4]2019年報(bào)道了一株高效異養(yǎng)硝化細(xì)菌（Pseudomonas aeruginosa YL），結(jié)果表明，菌株YL不但具有高效的異養(yǎng)硝化能力，而且具有好氧反硝化能力。本研究在泰安市泰山區(qū)奈河城區(qū)河段分離培養(yǎng)出異養(yǎng)型具有亞硝化能力的一株細(xì)菌，經(jīng)16SrRNA測(cè)序鑒定，屬于黃苷菌屬，生化鑒定為金黃桿菌Ⅱb。此類細(xì)菌的存在，與其所處環(huán)境的微生物生態(tài)環(huán)境直接相關(guān)，并且在整個(gè)生態(tài)鏈條中發(fā)揮著不可或缺的作用。

表1 4號(hào)菌株生化反應(yīng)結(jié)果

生物轉(zhuǎn)化是氨氮污染處理最經(jīng)濟(jì)和有效的方法。近年的研究表明，除了自養(yǎng)硝化細(xì)菌能夠進(jìn)行高效的硝化作用，異養(yǎng)硝化作用在自然界的氮循環(huán)過程中也起著重要作用，同時(shí)也為異養(yǎng)硝化菌在水質(zhì)環(huán)境改善中的推廣應(yīng)用儲(chǔ)備了菌種資源并奠定了良好的理論研究基礎(chǔ)[5]。本研究所分離培養(yǎng)和鑒定的菌株能夠較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境和氣候條件，符合這一條件的細(xì)菌，可作為對(duì)應(yīng)特征應(yīng)用的候選菌株，同時(shí)可以運(yùn)用必要的馴化手段，使其更好地適應(yīng)實(shí)踐需求[6]。

泰安市泰山區(qū)主城區(qū)北鄰泰山，奈河水系城區(qū)段起源于景區(qū)，橫貫城區(qū)，與城市環(huán)境和人群生產(chǎn)生活密切相關(guān)。本研究通過采集該河段水樣，抽濾濃集后，使用改良斯蒂芬遜培養(yǎng)基A型進(jìn)行選擇性增菌、分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)，獲得樣品中具有特定代謝類型的微生物，并通過硝化能力測(cè)試，明確具有亞硝化能力的菌株。通過對(duì)菌株基因組的16SrDNA的測(cè)序和比對(duì)，明確分離菌株屬于黃桿菌屬細(xì)菌。最后通過形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性以及生化鑒定，最終確定所分離菌株屬于金黃桿菌Ⅱb。本研究未能在水樣中分離培養(yǎng)出自養(yǎng)型硝化細(xì)菌，可能與采樣區(qū)域環(huán)境長期受到人類生產(chǎn)生活影響，生態(tài)菌群特征與其相適應(yīng)的結(jié)果?？梢酝ㄟ^相應(yīng)區(qū)域樣品的宏基因組學(xué)檢測(cè)加以明確。4號(hào)菌株雖然被鑒定為金黃桿菌Ⅱb，但是其28 ℃生長良好，37 ℃生長不良，血瓊脂平板生長不良，無溶血現(xiàn)象，屬于環(huán)境菌群，對(duì)人無致病性。所以，可以對(duì)該類菌種進(jìn)行深入的研究。

黃桿菌屬是一種非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，是以產(chǎn)生黃色素為特征的一個(gè)菌屬，廣泛存在于淡水、海水、土壤和植物中。甘美君等[7]2017年報(bào)道了1株從地表土壤中篩選得到的黃苷菌屬高效硝化細(xì)菌，16SrDNA基因測(cè)序與菌株Flavobacterium sasangense YC6274T的親緣性達(dá)到99.7%。菌株FL211T不但具有異養(yǎng)硝化能力，還具有好氧反硝化能力，同時(shí)異養(yǎng)硝化能力更突出。

3 結(jié)論

本研究分離的異養(yǎng)硝化細(xì)菌為首次被報(bào)道，其生物學(xué)特征在環(huán)境氨氮代謝方面具有較好的應(yīng)用潛力。但是，除了其亞硝化能力被確認(rèn)以外，其他代謝特征還需要進(jìn)一步研究和明確。