脂聯(lián)素、IL-32及P-選擇素在急性肺損傷大鼠血清及肺組織中的表達(dá)

馬 莉，劉 宏，榮 芳

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)呼吸病與職業(yè)病研究所，山西大同 037009）

急性肺損傷是一種臨床上常見的危重病癥，死因多為急性呼吸窘迫綜合征和多臟器功能障礙綜合征[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，白介素-32(Interleukin-32,IL-32)可促進(jìn)IL-6、IL-8、和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等表達(dá)[2-3]；P-選擇素主要介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，參與炎癥反應(yīng)、啟動及擴(kuò)大血栓形成[4]；脂聯(lián)素可能對許多疾病有保護(hù)作用[5]。目前這3 種細(xì)胞因子對急性肺損傷的作用尚不清楚。本課題以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，觀察脂聯(lián)素、IL-32和P-選擇素在急性肺損傷大鼠血清及肺組織中的表達(dá)，分析三者在大鼠急性肺損傷中的變化規(guī)律，以探討急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量200±20 g，購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。動物隨機(jī)分為生理鹽水對照組(NS組)(n=20)和LPS急性肺損傷組(LPS組)(n=20)。每組分為4批(2 h、6 h、24 h和72 h)，每批5只大鼠。LPS組腹腔內(nèi)注射LPS(8 mg/kg)制備急性肺損傷模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水。注射后2 h、6 h、24 h和72 h，分別處死動物。

1.2 觀察指標(biāo)

LPS組和NS組大鼠分別于LPS腹腔注藥后2 h、6 h、24 h、72 h 去眼球取血，分離血清置于冰箱-70 ℃保存?zhèn)溆?，檢測相應(yīng)的ELISA試劑盒(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)檢測脂聯(lián)素、IL-32及P-選擇素水平。

取右肺前葉組織放入凍存管中，液氮中保存待檢。將冷凍肺組織與液氮一起碾磨，放入組織勻漿器，加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白。最后采用Western blot法檢測肺組織中脂聯(lián)素、IL-32和P-選擇素蛋白含量。方法如下：提取各組肺組織總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度后，取30 μg 蛋白樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃(美國Sigma 公司)孵育過夜，以β-actin 為內(nèi)參照。用TBST 洗膜后，加二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育1 h，ECL 顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用重復(fù)測量的方差分析，使用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)后多重比較。P＜0.05時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對大鼠血清中脂聯(lián)素、IL-32及P-選擇素表達(dá)的影響

2 組患者在注射后2 h、6 h、24 h 和72 h 進(jìn)行血清脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①2 組比較不同時間點(diǎn)血清脂聯(lián)素、IL-32和P-選擇素有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；②NS組大鼠血清脂聯(lián)素、IL-32和P-選擇素不同時間點(diǎn)變化無差別(F=4.258,P=0.087；F=3.906,P=0.102；F=6.765,P=0.063)；③LPS 組血清脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素變化趨勢有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.147,P=0.001；F=18.476,P=0.010；F=26.961,P＜0.001)，見表1～3。

表1 2組大鼠血清中脂聯(lián)素定量分析 /pg·mL-1

表2 2組大鼠血清中IL-32定量分析 /pg·mL-1

表3 2組大鼠血清中P-選擇素定量分析 /pg·mL-1

2.2 Western blot分析

2組大鼠在注射后2 h、6 h、24 h和72 h進(jìn)行肺組織中脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①2 組之間不同時間點(diǎn)血清脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；②NS 組血清脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素不同時間點(diǎn)變化無差別(F=5.093,P=0.079；F=4.361,P=0.094；F=7.418,P=0.053)；③LPS 組血清脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素變化趨勢有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=22.937,P＜0.001；F=16.728,P=0.017；F=28.092,P＜0.001)，見表4～6。

表4 2組大鼠肺組織中脂聯(lián)素定量分析 /pg·mL-1

表5 2組大鼠肺組織中IL-32定量分析 /pg·mL-1

表6 2組大鼠肺組織中P-選擇素定量分析 /pg·mL-1

3 討論

急性肺損傷是由多種病因引起的急性呼吸衰竭，是臨床各科常見危重病癥。其中呼吸窘迫綜合征是急性肺損傷的嚴(yán)重階段，死亡率很高，其發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚。本研究通過在大鼠腹腔注射LPS 制備肺損傷模型，大鼠在注射LPS 2 h 后出現(xiàn)蜷縮少動，反應(yīng)遲鈍，呼吸明顯加快，而注射NS的大鼠狀態(tài)無明顯變化。

研究結(jié)果顯示，不管是血清還是肺組織，LPS組大鼠注射后2、6、24和72 h脂聯(lián)素含量均明顯低于NS 組；而LPS 組大鼠注射后2、6、24和72 h IL-32和P-選擇素含量均明顯高于NS 組。而且在24 h時2 組之間差異最大，在72 h 時差異減少，提示大鼠在注射LPS 24 h時肺組織損傷最嚴(yán)重。脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，最近研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和保護(hù)血管的作用[6]。此外，動物實(shí)驗(yàn)表明，脂聯(lián)素對于維持肺的免疫穩(wěn)態(tài)具有重要的作用[7]。因而脂聯(lián)素具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及抗炎抗氧化等作用，而急性肺損傷大鼠中脂聯(lián)素降低，提示其保護(hù)作用減弱。IL-32 是一種編碼炎癥性細(xì)胞因子，可通過激活NF-κB、p38 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化和caspase-1 依賴途徑誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-2、TNF-α等細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)過程[2]。Arcaroli 等人研究發(fā)現(xiàn)，IL-32 參與急性肺損傷的炎癥反應(yīng)，其水平與肺組織的損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)[8]。本研究中，大鼠急性肺損傷后IL-32 濃度持續(xù)增高，可能參與炎癥反應(yīng)。P-選擇素是血小板活化的靈敏標(biāo)記物，與免疫損傷、炎癥反應(yīng)和血栓的形成密切相關(guān)[9]。有研究報(bào)道，急性肺損傷E-選擇素濃度顯著增高，肺組織中P-選擇素表達(dá)增加[10]。這與本研究結(jié)果是一致的。

本研究表明，IL-32和P-選擇素可能參與肺組織損傷，脂聯(lián)素的保護(hù)作用減弱。但是本實(shí)驗(yàn)僅對脂聯(lián)素、IL-32 和P-選擇素進(jìn)行了檢測，其調(diào)控機(jī)制不明確，以后實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步對其調(diào)控途徑機(jī)制進(jìn)行研究。