基于腫瘤公共數(shù)據(jù)庫分析TUFM基因在肺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義＊

李素芬，王唯斯，楊 娜，梅 雯，孫美濤，余 敏，熊 偉

肺癌是所有惡性腫瘤中導(dǎo)致人類死亡最為常見的原因［1］。2018年，全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計大概有180萬人因肺癌死亡，達(dá)到惡性腫瘤致死總數(shù)的18.4%［2］。因為肺癌通常在就診時就已經(jīng)是晚期，手術(shù)切除的可行性受到很大限制，而全身性藥物治療的重點是控制癥狀和延長生存期［3］，但晚期肺癌患者的生存率仍然很低［4］。

哺乳動物的線粒體執(zhí)行許多基本的細(xì)胞功能，包括血紅素和磷脂的生物合成、能量的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡等［5］。隨著對線粒體研究的不斷深入，人們對參與哺乳動物線粒體蛋白質(zhì)翻譯的蛋白質(zhì)因子及其翻譯的基本過程認(rèn)識逐漸清晰，線粒體翻譯延伸因子 Tu（mitochondrial translation elongation factor Tu，TUFM）作為線粒體蛋白質(zhì)翻譯延長因子之一，參與線粒體翻譯的延長過程［6］。He等研究者把肺癌細(xì)胞A549中的TUFM基因敲低后，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)升高，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（pithelial-mesenchymal transition，EMT），提示TUFM基因在肺癌組織中的表達(dá)水平和肺癌的進(jìn)展密切相關(guān)［7］。筆者擬通過多種腫瘤公共數(shù)據(jù)庫分析探討TUFM基因在肺癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源Oncomine（https：//www.oncomine.org/）是包括715個數(shù)據(jù)集和86，733個樣本數(shù)的基因芯片數(shù)據(jù)庫，可以從數(shù)據(jù)中自動提取生物信息［8］。GCBI 數(shù) 據(jù) 庫 （https：//www.gcbi.com.cn/gclib/html/index）是一種可以在線設(shè)計分析流程、進(jìn)行基因數(shù)據(jù)分析的數(shù)據(jù)庫，可以查找生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)，輸入基因得到基因信息，找到基因樣本，以及清楚標(biāo)出樣本類型［9］。 基因表達(dá)譜動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA） （http：//gepia.cancer-pku.cn/）可以對TCGA數(shù)據(jù)集和基因型組織表達(dá)（GTEx）數(shù)據(jù)集進(jìn)行可視化分析［10］。 通過使用Oncomine數(shù)據(jù)庫、GCBI數(shù)據(jù)庫和GEPIA在線分析軟件分析TUFM基因在不同腫瘤之間的表達(dá)水平以及正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá)差異。Kaplan-MeierPlotter 數(shù) 據(jù) 庫 （http：//kmplot.com/analysis/）是一個mRNA表達(dá)譜芯片的公共數(shù)據(jù)庫，包括54675個基因、10461個癌癥樣本，涉及乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌以及肝癌。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析TUFM基因表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系［11］。人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA）（https：//www.proteinatlas.org/）是一種開放獲取數(shù)據(jù)的程序，運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析得到基因在正常組織和腫瘤組織中的免疫組化圖像［12］。檢索HPA得到TUFM基因在正常肺組織和肺癌組織表達(dá)的免疫組化結(jié)果。

1.2數(shù)據(jù)庫檢索通過Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索TUFM在肺癌和正常肺組織中的基因表達(dá)差異。Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索分析TUFM基因的設(shè)定條件為：（1）“基因：TUFM”；（2）“分析類型： 腫瘤 vs. 非腫瘤”；（3）“腫瘤類型： 肺癌”；（4）“數(shù)據(jù)類型：mRNA”；（5）“樣本類型：臨床樣本”；（6）臨界值設(shè)定（P 值＜1E-4，fold change 2，gene rank=top10% ）。（7）其他為數(shù)據(jù)庫默認(rèn)設(shè)定。檢索結(jié)束后，選擇TUFM基因與肺癌的相關(guān)研究進(jìn)行比較。

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫對肺腺癌和肺鱗癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行可視化分析，輸入TUFM基因名稱，然后選擇肺腺癌數(shù)據(jù)集LUAD、肺鱗癌數(shù)據(jù)集LUSC進(jìn)行分析。

根據(jù)TCGA肺癌數(shù)據(jù)集中TUFM mRNA表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對TUFM mRNA高表達(dá)組和TUFM mRNA低表達(dá)組與肺癌患者生存預(yù)后信息進(jìn)行分析，并分別繪制首次進(jìn)展生存期（first-progression survival，F(xiàn)P）、 總生存期 （overall survival，OS）、復(fù)發(fā)后生存期（post-progression survival，PPS）生存函數(shù)曲線。設(shè)定條件為：（1）Cancer Type：Lung cancer； （2）Gene symbol：TUFM； （3）Splitpatients by：Auto select best cutoff； （4）Survival：FP、OS、PPS；（5）其他為數(shù)據(jù)庫默認(rèn)設(shè)定。

使用人類蛋白質(zhì)圖譜HPA，從正常肺組織和肺癌中的人蛋白質(zhì)圖譜中提取了可用于臨床的免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）數(shù)據(jù)。 選擇了高表達(dá)和低表達(dá)模式驗證TUFM基因在肺癌組織中具有作為分子靶向治療基因的可能性。

1.3數(shù)據(jù)庫中的觀察指標(biāo)通過Oncomine數(shù)據(jù)庫和GCBI數(shù)據(jù)庫觀察TUFM基因在常見腫瘤表達(dá)差異。使用Oncomine數(shù)據(jù)庫觀察TUFM基因與肺癌的相關(guān)研究數(shù)據(jù)并進(jìn)行綜合分析。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫、GCBI數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫，觀察TUFM基因在正常肺組織和肺癌之間的表達(dá)差異。使用人類蛋白質(zhì)圖譜HPA查看和分析TUFM基因在肺組織中的表達(dá)情況，以及 TUFM基因在肺癌組織中的表達(dá)情況，獲取免疫組化的預(yù)測結(jié)果圖像。此外，利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫觀察TUFM基因與肺癌患者各項生存預(yù)后指標(biāo)（FP、OS和PPS）之間的關(guān)系。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析由腫瘤公共數(shù)據(jù)庫分析得到所有統(tǒng)計分析結(jié)果，TUFM在正常肺組織和肺癌組織中的差異比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析TUFM基因與肺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，以Logrank P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUFM基因在人體常見腫瘤中的表達(dá)Oncomine數(shù)據(jù)庫在線檢索后發(fā)現(xiàn)，該數(shù)據(jù)庫共收集了946項TUFM基因針對不同腫瘤類型的研究結(jié)果，其中關(guān)于TUFM基因表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異的研究結(jié)果共113項。其中TUFM基因表達(dá)在常見腫瘤中升高的研究有35項。從GCBI數(shù)據(jù)庫中可以看到，TUFM基因在肺鱗癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種常見腫瘤中的表達(dá)量均高于正常組織，見圖1。GCBI數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌組織與正常肺組織相比：TUFM基因在正常肺組織中平均表達(dá)值是2843.9，癌組織是4456.47，提示TUFM基因在肺鱗癌中高表達(dá)，見圖1A。肺腺癌組織與正常肺組織相比：TUFM基因在正常肺組織中平均表達(dá)值是2977.3，癌組織是4399.76，提示TUFM基因在肺腺癌中高表達(dá)，見圖1B。

2.2 TUFM在肺癌組織及正常肺組織的表達(dá)差異通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，2001年—2012年共有19項研究涉及TUFM基因在正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá)。TUFM基因在肺癌所有差異表達(dá)基因中的排名中位數(shù)為2753.0（P=0.044），且TUFM基因在肺癌中高表達(dá)，見圖2。對Oncomine數(shù)據(jù)庫中不同類型肺癌芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，肺鱗癌、肺腺癌、大細(xì)胞肺癌以及小細(xì)胞肺癌組織中的TUFM基因均呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.05），見圖3。使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分別對肺腺癌和肺鱗癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行可視化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常肺組織（n=338）和肺鱗癌組織（n=486）相比，肺鱗癌組織中TUFM mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 4A。 相較于正常肺組織（n=347），肺腺癌（n=483）中TUFM mRNA表達(dá)水平也顯著升高（P＜0.05），見圖 4B。

2.3人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫查找正常肺組織及肺癌組織的IHC結(jié)果從人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫（HPA）提取了TUFM在正常肺組織和肺癌組織中特征化的IHC圖像。正常肺組織與肺癌組織TUFM蛋白質(zhì)陽性染色均定位于細(xì)胞質(zhì)。正常的肺組織TUFM基因陽性染色不均勻，在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性，在正常肺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是弱陽性，兩種陽性染色混合存在，見圖5A。在肺癌組織中，TUFM基因在不同的腫瘤細(xì)胞組織的細(xì)胞質(zhì)呈染色強(qiáng)陽性或弱陽性，見圖5B，圖5C。在正常肺組織和肺癌組織中TUFM基因陽性染色均存在明顯的區(qū)別。

2.4肺癌患者TUFM基因的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系檢索Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫，低表達(dá)TUFM基因肺癌患者的生存預(yù)后較差。TUFM高表達(dá)組肺癌患者的FP、OS和PPS均顯著優(yōu)于低表達(dá)組，見圖6。在FP中，TUFM mRNA高表達(dá)組患者的中位生存時間明顯高于TUFM mRNA低表達(dá)患者（34.53月vs.11.17月）。在OS中，TUFM mRNA高表達(dá)組患者的中位生存時間明顯高于TUFM mRNA低表達(dá)組 （108.97月vs.45.27月）。在PPS中，TUFM mRNA高表達(dá)組患者的中位生存時間也明顯高于TUFM mRNA低表達(dá)組（20.20月vs.8.98月）。

圖6見封三。

圖6 肺癌中TUFM基因的表達(dá)水平與生存預(yù)后之間的關(guān)系

3 討論

TUFM蛋白在線粒體基因編碼的蛋白質(zhì)翻譯過程中參與氨基酸延伸、密碼子-反密碼子互補(bǔ)配對以及校正氨基酸-tRNA配對［13］。TUFM蛋白可以正確識別氨基酰-tRNA并將其與GTP復(fù)合物共同轉(zhuǎn)運至核蛋白體完成轉(zhuǎn)位［14］，若氨基酰-tRNA能迅速與反密碼子-密碼子互補(bǔ)配對結(jié)合，則進(jìn)入A位，若氨基酰-tRNA不能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，則從A位解離［15］。TUFM不僅對于線粒體蛋白質(zhì)翻譯的保真度非常重要，也是參與線粒體蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶［16］。He等研究證明，在肺癌細(xì)胞中敲低TUFM基因時，肺癌細(xì)胞線粒體基因編碼蛋白的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致線粒體功能遭到破壞，ROS生成增加［7］。敲低TUFM基因可促進(jìn)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞和小鼠體內(nèi)肺癌發(fā)生EMT過程，導(dǎo)致腫瘤遷移和侵襲［7］。在肺癌患者中，發(fā)生EMT的肺癌患者呈現(xiàn)TUFM低表達(dá)，因此，低表達(dá)的TUFM基因可降低肺癌患者預(yù)后。而TUFM高表達(dá)組的肺癌患者可能還未出現(xiàn)遷移和侵襲，因此患者的預(yù)后比低表達(dá)組好。然而，TUFM基因?qū)е路伟┌l(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍不清楚，有待于進(jìn)一步探討。

圖1 GCBI數(shù)據(jù)庫中TUFM基因在正常組織和人體各腫瘤組織中的表達(dá)

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中19項TUFM基因在肺癌組織表達(dá)水平的研究

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TUFM基因在肺癌及正常肺組織中的表達(dá)

圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫中TUFM mRNA在肺癌組織與正常肺組織之間的相對表達(dá)

圖5 正常肺組織及肺癌組織的IHC結(jié)果

使用Oncomine數(shù)據(jù)庫、GCBI數(shù)據(jù)庫、GEPIA數(shù)據(jù)庫、HPA數(shù)據(jù)庫以及Kaplan-Meier Plotter對TUFM基因在肺癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了整合的生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，與正常肺組織相比，TUFM mRNA在各種類型的肺癌組織中均高表達(dá)（P＜0.05）。TUFM基因在包括肺鱗癌和肺腺癌在內(nèi)的多種人類常見腫瘤中的表達(dá)量均高于對應(yīng)的正常組織。TUFM基因在正常的肺組織以及肺癌組織中IHC結(jié)果存在明顯差別。最后，TUFM基因高表達(dá)組肺癌患者的預(yù)后結(jié)果較低表達(dá)組良好，可能是由于高表達(dá)TUFM基因抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，因此，TUFM基因表達(dá)水平與肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。最近，Xu等研究發(fā)現(xiàn)，泛素特異性肽酶5（Ubiquitin specific peptidase 5，USP5） 和TUFM 基因在原發(fā)性結(jié)直腸癌組織中均高表達(dá)，并且與患者的預(yù)后相關(guān)。過表達(dá)USP5基因促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，USP5基因可使TUFM基因去泛素化，提高TUFM基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平［17］。研究還發(fā)現(xiàn)TUFM基因表達(dá)下調(diào)可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中USP5基因的水平，表明過表達(dá)的TUFM基因發(fā)揮負(fù)反饋作用以減少去泛素化，提高結(jié)直腸患者預(yù)后生存時間［17］。此外，有研究表明，在具有氧化磷酸化依賴性的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，抑制TUFM基因可選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞毒性［18］。

該文通過數(shù)據(jù)庫綜合分析發(fā)現(xiàn)，TUFM在肺癌組織中高表達(dá)，提示TUFM基因可能參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，并提示TUFM基因可能成為肺癌治療干預(yù)的有效靶點。