茜草炮制前后紅外圖譜分析

崔麗麗，梁振華，高 莉，徐鑫麗，董鑫宇，羅娥娥，李昌勤*

1. 河南省功能食品工程技術(shù)研究中心，河南 開封 475004; 2. 河南省藥食兩用資源功能研究國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004; 3. 開封市功效成分研究與保健食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004

紅外光譜技術(shù)在注重整體效果上和中藥炮制非常一致，紅外光譜譜圖可顯示樣品中所有組分的光譜特征，并且組分的不同和含量的差異會(huì)在譜圖上有清楚的表現(xiàn)。因此，紅外光譜技術(shù)能夠反映藥材的整體特性，符合中醫(yī)藥的理論，從而可以利用其直接地對(duì)樣本的品質(zhì)進(jìn)行宏觀把握控制[1]。

茜草為茜草科植物茜草(Rubiacordifolia)的干燥根和根莖，味苦，性寒，歸肝經(jīng)，有涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)的功效，臨床用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛[2]。炒炭后，其寒性減弱、味苦澀、性變收澀，以止血為主[3]，臨床用于血痢、尿血、咯血、崩漏出血等[4]。本試驗(yàn)以茜草為研究對(duì)象，首次采用紅外光譜技術(shù)，結(jié)合紅外一維原譜與二階導(dǎo)數(shù)譜，對(duì)茜草炮制前后化學(xué)成分的變化進(jìn)行分析，以考察紅外光譜儀在中藥炮制品檢測(cè)方面應(yīng)用的可行性。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 儀器設(shè)備

IR Affinity-1s傅里葉紅外光譜儀(島津企業(yè)管理有限公司)、電子天平(佑科儀器)、HW-3型紅外烘干箱(天津市拓普儀器有限公司)、DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、AL204型十萬級(jí)電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、100目分樣篩(上虞市儀器紗篩廠)、平底鍋、電磁爐、電爐、碾子、噴壺、研缽。

1.2 樣品來源

茜草飲片于2016年9月購(gòu)于河南禹州藥材市場(chǎng)，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院中藥研究所李昌勤教授鑒定為茜草科茜草屬茜草(Rubiacordifolia)。茜草炭為本實(shí)驗(yàn)室自行炮制。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備[2]

茜草：取原藥材，除去雜質(zhì)及其殘莖，搶水洗凈，撈出，潤(rùn)透后及時(shí)切段，干燥。

茜草炭：取凈茜草段，置鍋內(nèi)用武火加熱炒至表面焦黑色，內(nèi)部棕褐色，用噴壺噴淋清水少許，滅盡火星，取出，放涼。

2.2 方法學(xué)考察

茜草粉碎，過100目篩。粉末均采用KBr壓片法，取樣品2.0 mg，KBr 100.0 mg于瑪瑙研缽內(nèi)，在紅外干燥箱內(nèi)充分研磨均勻，然后取粉末15.0 mg于模具中，壓力為2 tons，壓成均勻、透明的薄片，在室溫下對(duì)所壓的片進(jìn)行掃描，獲得各樣品的一維紅外譜圖。掃描條件：光譜測(cè)量范圍4 000～400 cm-1，掃描信號(hào)累加20次，掃描時(shí)實(shí)時(shí)扣除水和二氧化碳的干擾。

2.2.1 精密度考察

將同一茜草樣品連續(xù)掃描5次，將所得到的圖譜進(jìn)行相似度比較，各圖譜相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、1.000 0、0.999 9、0.999 9、0.999 9，RSD=0.005 477 6%，表明精密度良好。

2.2.2 重現(xiàn)性考察

取同一茜草樣品，分別稱量，重復(fù)壓片5次，逐一進(jìn)行掃描測(cè)定，對(duì)所得的紅外譜圖進(jìn)行相似度比較，各圖譜相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.999 4、0.988 4、0.988 9、0.994 5，RSD=0.559 6%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性，符合試驗(yàn)分析的要求。

2.2.3 穩(wěn)定性考察

取同一茜草樣品片放入真空干燥器內(nèi)保存，每隔0.5 h測(cè)定一次，對(duì)所得到的圖譜進(jìn)行比較，結(jié)果在3 h內(nèi)所測(cè)得的圖譜基本一致，各圖譜相關(guān)系數(shù)分別為1.000 0、0.999 3、0.998 5、0.998 3、0.998 0、0.997 7、0.997 1，RSD=0.099 8%。表明樣品在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 樣品檢測(cè)

茜草、茜草炭干燥后，粉碎，過100目篩。取茜草及茜草炭樣品各2.0 mg，按2.2項(xiàng)下方法檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 生品及炮制品的一維紅外光譜分析

圖1 茜草生品和炮制品的紅外光譜圖

進(jìn)一步選取不同波段進(jìn)行分析，見圖2。茜草炭品與其生品相比，炒炭后在3 861.49 cm-1及3 741.90 cm-1處均出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，而2 858.51 cm-1處的峰消失。3 421.72 cm-1及2 927.94 cm-1為多糖的特征峰，炒炭后二者的強(qiáng)度均增強(qiáng)。

圖2 茜草生品和炮制品在4 000～2 600 cm-1波段的一維原譜圖

1 647 cm-1處的峰炒炭后紅移至1 643.35 cm-1，1 612.49 cm-1炒炭后峰的強(qiáng)度增大；炒炭后在1 516.05 cm-1、1 450.47 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰。1 435.04 cm-1處的峰發(fā)生紅移至1 427.32 cm-1，1 381.03 cm-1炒炭后紅移至1 373.32 cm-1，且峰的強(qiáng)度明顯增大，1 242.16 cm-1處的峰炒炭后強(qiáng)度增大，峰形變鈍且藍(lán)移至1 265.30 cm-1；炒炭后1 157.29 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，1 033 cm-1處的峰炒炭后強(qiáng)度略有降低，峰形變鈍并且紅移至1 053.13 cm-1；炒炭后779.24 cm-1處的峰強(qiáng)度增強(qiáng)，659.66 cm-1處的峰炒炭后強(qiáng)度增大且藍(lán)移至663.51cm-1，524.64cm-1的峰炒炭后強(qiáng)度增強(qiáng)，且紅移至520.78 cm-1。466.77cm-1處的峰強(qiáng)度增強(qiáng)且藍(lán)移至470.63 cm-1。424.33 cm-1處炒炭后出現(xiàn)新的吸收峰，見圖3。

圖3 茜草生品和炮制品在2 000～400cm-1波段的一維原譜圖

3.2 生品及炮制品的二階導(dǎo)數(shù)譜分析

圖4 茜草生品和炮制品的二階導(dǎo)數(shù)譜

茜草與茜草炭的二階導(dǎo)數(shù)譜在4 000 ～2 700 cm-1、2 000 ～400 cm-1均有明顯差異，總體上看炒炭后峰的強(qiáng)度增大。

進(jìn)一步選取不同波段進(jìn)行分析，則可以看出，炒炭后樣品中低波數(shù)出現(xiàn)明顯強(qiáng)單峰，在茜草生品中3 784.34 cm-1峰含右肩峰，而在茜草炭中為雙峰，且峰的強(qiáng)度明顯大于茜草生品，3 687cm-1峰炒炭后藍(lán)移至3 695.61 cm-1，且變?yōu)榧鈴?qiáng)峰。3 637.75 cm-1炒炭后紅移至3 633.89 cm-1且強(qiáng)度增強(qiáng)。茜草生品3 394.72 cm-1含右肩峰，茜草炭3 398.57 cm-1為雙峰，且3 398.57 cm-1峰強(qiáng)度大于3 394.72 cm-1。在茜草生品中2 993.52 cm-1處不含有左肩峰，而在茜草炭中含有左肩峰，且峰強(qiáng)度增大。2 900.94 cm-1在茜草生品中含右肩峰，炒炭后右肩峰消失。

圖5 茜草生品和炮制品在4 000～2 700 cm-1波段的二階導(dǎo)數(shù)譜

茜草生品中1 708.93 cm-1含有右肩峰，炒炭后右肩峰消失且峰藍(lán)移至1 689.64 cm-1，茜草生品在1 581.63 cm-1處含右肩峰，炒炭后變?yōu)殡p峰。1 400.32 cm-1在茜草生品中含左肩峰，炒炭后左肩峰的強(qiáng)度增大。1 184.29 cm-1處在茜草生品中有左肩峰炒炭后左肩峰消失。此處圖中數(shù)據(jù)標(biāo)錯(cuò)圖中寫的1 084.29在茜草生品中1 087.85 cm-1及1 065.85 cm-1的峰強(qiáng)度比例相差不大，炒炭后1 065.85 cm-1藍(lán)移至1 045.42 cm-1，且兩峰的峰強(qiáng)的比例增大。937.40 cm-1、860.25 cm-1峰在茜草生品中不含有右肩峰，炒炭后出現(xiàn)右肩峰。860.25 cm-1炒炭后出現(xiàn)右肩峰，且向紅移至864.11 cm-1。543.93 cm-1峰炒炭后藍(lán)移至540.07 cm-1，且峰的強(qiáng)度增大并出現(xiàn)左肩峰582.50 cm-1。見圖6。

圖6 茜草生品和炮制品在1 900～400cm-1波段的二階導(dǎo)數(shù)譜

4 討論

目前對(duì)茜草炮制前后有關(guān)化學(xué)成分的研究較少，且研究對(duì)象大多是單一的化合物或者是總蒽醌類，主要集中在大葉茜草素、羥基茜草素和1,3-二羥基蒽醌3種成分[5-7],炮制后總蒽醌以及萘醌大葉茜草素含量降低[8]，1,3二羥基蒽醌含量顯著增加[9]。茜草炮制前后的一維譜圖中的3 421.72 cm-1、3 344.57 cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 643.35(1 647.21) cm-1的吸收峰可能同時(shí)包含芳香環(huán)骨架振動(dòng)吸收以及共軛羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 612.49 cm-1、1 516.05 cm-1為芳香環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰，此兩類峰為醌類化合物紅外光譜的主要特征峰。本研究團(tuán)隊(duì)在應(yīng)用紅外光譜技術(shù)分析白芷炮制前后有效成分含量復(fù)化的基礎(chǔ)上[10]，對(duì)茜草采用紅外光譜法對(duì)茜草炮制前后化學(xué)成分的整體變化進(jìn)行測(cè)定，茜草炭炮制后的圖譜就一維圖譜分析，發(fā)現(xiàn)3 600cm-1左右新增兩處吸收峰，3 400 cm-1、2 900 cm-1處的峰增，這說明可能會(huì)有部分含羥基的物質(zhì)增加，強(qiáng)二維譜圖中可以明顯看出3 000 cm-1以上的峰的強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng)，1 800 cm-1波長(zhǎng)下的圖譜峰的位置和峰形有明顯的變化。有實(shí)驗(yàn)研究[11]表明，茜草炮制后大葉茜草素的含量減少，羥基茜草素，1,3-二羥基蒽醌含量增加，本試驗(yàn)結(jié)果表明茜草炮制后其含羥基的物質(zhì)含量增加的可能是羥基茜草素等多羥基醌類化合物。說明茜草炮制前后其化學(xué)成分發(fā)生了明顯的變化，有部分化學(xué)成分增強(qiáng)，部分化學(xué)成分減少，從而影響其臨床藥理作用。

茜草生品及茜草炭品具有明顯的紅外“指紋”特征，可通過利用紅外光譜技術(shù)快速鑒別藥材生品及其炮制品。對(duì)比茜草生品、茜草炭品的一維原譜譜圖及二階導(dǎo)數(shù)譜圖可以看出，二階導(dǎo)數(shù)譜能夠放大紅外光譜上的細(xì)微差異，提高紅外光譜的分辨率。若想增強(qiáng)對(duì)樣本信息的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)相似混合物樣本的區(qū)分鑒別，需借助二維相關(guān)紅外光譜，通過紅外光譜三級(jí)鑒別法進(jìn)行進(jìn)一步的分析。