解淀粉芽胞桿菌YU-1對(duì)水稻紋枯病的防治作用

鄭少兵　孫正祥　徐夢(mèng)亞

摘要 本文旨在篩選對(duì)水稻紋枯病有生防作用的菌株，并初步探索其生防作用機(jī)理。收集水稻、甘藍(lán)、黃瓜等不同植物根際土壤，采用稀釋分離和對(duì)峙培養(yǎng)法篩選對(duì)水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani Kühn有抑菌作用的菌株;通過離體接種防效、盆栽防效、抑菌譜、對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)及形成的抑制作用等方面評(píng)價(jià)其生防潛力，并對(duì)生防菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從采集的37份根際土壤中共分離獲得細(xì)菌297株，其中4株對(duì)紋枯病菌具有較好的拮抗作用，菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制率達(dá)89.8%;對(duì)西瓜枯萎病菌、草莓灰霉病菌、番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制率均在85%以上;對(duì)水稻紋枯病的離體和盆栽防效分別為73.1%和66.3%;對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)的抑菌率在92%以上;經(jīng)生理生化和分子鑒定為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens。由此可看出，菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的防治具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值，具有進(jìn)一步開發(fā)成生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞 水稻紋枯病; 根際; 生防作用; 解淀粉芽胞桿菌

中圖分類號(hào)： S 476.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019141

Control effect of Bacillus amyloliquefaciens YU-1 on rice sheath blight

ZHENG Shaobing1，2， SUN Zhengxiang2*， XU Mengya2，3

（1. Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Disease and Insect Pests， Nanning 530007， China;

2. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， China; 3. Laboratory of Microbial

Resources Collection and Preservation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100081， China）

Abstract

This study was aimed to discover bacterial strain with biocontrol activity against rice sheath blight （RSB） and preliminarily explore its biocontrol mechanism. The bacterial strains isolated from rhizosphere of rice， cabbage， cucumber et al.， with strong antagonistic effects on Rhizoctonia solani Kühn（RS）， were screened by confrontation culture. The biocontrol potential was evaluated by vitro inoculation， pot experiments， antagonistic spectrum， germination inhibition and sclerotium formation tests. The results showed that the inhibition activity of stain YU-1 on RS mycelia growth was 89.8%， and that on mycelia growth of watermelon wilt， strawberry grey mould， tomato early blight， rapeseed germ and wheat red mould was more than 85%. Control efficacies on RSB were 73.1% and 66.3% in vitro and pot tests， respectively. The germination inhibition on RS sclerotium was more than 92%. Based on physiological and biochemical characteristics and molecular naturalization identification， the strain YU-1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. These results showed that strain YU-1 had strong application value to control RSB and significant potential to be developed into biopesticide.

Key words

rice sheath blight; rhizosphere; biocontrol effect; Bacillus amyloliquefaciens

水稻是我國的主要糧食作物之一，由立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kühn侵染引起的紋枯病是水稻的三大病害之一[1]。病原菌形成的菌核抗性強(qiáng)，在土壤里存活時(shí)間長，發(fā)病時(shí)可以借助植物葉片橫向傳播，具有土傳和葉傳特點(diǎn)[2]。該病害一般可造成減產(chǎn)10%～30%，較重時(shí)減產(chǎn)達(dá)50%[3]。目前生產(chǎn)中尚無高抗品種，主要采用己唑醇、三唑酮、苯醚丙環(huán)唑、噻呋酰胺等化學(xué)藥劑防治，隨著生態(tài)環(huán)保及抗藥性問題逐漸受到關(guān)注，化學(xué)防治面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[4]。繼日本1968年發(fā)現(xiàn)有效霉素（validamyoin）后，1973年沈寅初等分離產(chǎn)validamyoin的鏈霉菌株被廣泛用于水稻紋枯病的防治，每年的防治面積超過0.087億hm2，但隨著病原菌的抗藥性增強(qiáng)，使用濃度雖逐年增加，防效卻逐年下降[5]。

近年來，生防微生物在水稻紋枯病的防治上呈現(xiàn)出較大的潛力，已報(bào)道的生防菌以細(xì)菌為主，如：芽胞桿菌、土壤放射桿菌、假單胞桿菌等，其中研究較多的為芽胞桿菌[6]。陳志誼等報(bào)道枯草芽胞桿菌Bs-916對(duì)水稻紋枯病具有良好的防效，防治效果為50.0%～81.0%[7]。陳劉軍等報(bào)道蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156對(duì)水稻紋枯病的室內(nèi)防效達(dá)73.06%[8]。Kumar等從水稻根際分離出4株對(duì)紋枯病菌具有拮抗作用的枯草芽胞桿菌，田間試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株UASP7在兩個(gè)生長季分別使紋枯病發(fā)病率減少11.93%和4.17%[9]。Yang等從牛糞中分離出多黏類芽胞桿菌SB177，田間試驗(yàn)結(jié)果表明其培養(yǎng)濾液在2013年和2014年對(duì)紋枯病的防效分別為71.1%和94.2%[10]。

本研究從水稻、甘藍(lán)、黃瓜等不同植物根際土壤中分離篩選對(duì)水稻紋枯病菌有抑制作用的生防細(xì)菌，并通過離體接種和盆栽試驗(yàn)對(duì)其生防效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為水稻紋枯病的生物防治提供更多的菌源，為我國糧食產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

水稻品種：‘武粳21（感病品種）。

病原菌：水稻紋枯病菌 R.solani、西瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum、草莓灰霉病菌 Botrytis cinerea、番茄早疫病菌 Alternaria solani，油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum和小麥赤霉病菌 F.graminearum Sehw.均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

供試藥劑：95%申嗪霉素，由上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司提供。

PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)液的配方參照陳天壽[11]。

1.2 水稻紋枯病菌生防菌株的分離與篩選

分離：從湖北荊州采集水稻、甘藍(lán)、黃瓜根際土，帶回實(shí)驗(yàn)室保存，備用。稱取土樣10 g，加入90 mL滅菌水中，160 r/min振蕩培養(yǎng)10 min，靜置30 min，取上清液1 mL，加到盛有9 mL無菌水的試管中，振蕩混勻，制成樣品懸浮液。取1 mL樣品懸浮液用無菌水依次進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取10-5、10-6、10-7的稀釋液50 μL涂布于NA平板，置于28℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤等特點(diǎn)，挑取不同菌落，轉(zhuǎn)接于NA平板上培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

初篩：將PDA平板培養(yǎng)2 d的水稻紋枯病菌接種于PDA平板中心，用滅菌的牙簽將上述分離的細(xì)菌純培養(yǎng)菌株呈三角狀對(duì)稱接入PDA平板，距離中心2 cm，28℃培養(yǎng)，觀察對(duì)峙培養(yǎng)抑菌情況并記錄抑菌圈大小。

復(fù)篩：將初篩抑菌作用明顯的菌株接種于NB液體培養(yǎng)基中，28℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得無菌濾液。濾液以1∶10的比例（V/V）與45℃的PDA培養(yǎng)基混合，制成平板，平板中央接水稻紋枯病菌菌餅（直徑為6 mm），以混入等量的NB培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)48 h，觀察與記錄菌落直徑。

相對(duì)抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.3 菌株YU-1的抑菌譜測定

參照上述復(fù)篩方法，測定菌株YU-1對(duì)西瓜枯萎病菌、草莓灰霉病菌、番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌菌落生長的抑制作用。

1.4 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的離體防效

采用葉片浸藥法測定。選擇等位且生長一致的健康水稻葉片，將其浸泡于菌株YU-1的懸浮液（OD600=1.0）中10 min，取出晾干后放置于水瓊脂培養(yǎng)基中，再將PDA平板培養(yǎng)2 d的水稻紋枯病菌菌餅（d=6 mm）接入葉片中央，每皿3個(gè)葉片，設(shè)置5個(gè)處理：NB培養(yǎng)液、YU-1懸浮液、NB培養(yǎng)液+紋枯病菌、YU-1懸浮液+紋枯病菌、0.005%申嗪霉素（有效成分1% 懸浮劑）+紋枯病菌，每處理重復(fù)10次。置于30℃培養(yǎng)箱，當(dāng)對(duì)照組（NB培養(yǎng)液+紋枯病菌）的葉片發(fā)病約90%時(shí)，觀察并記錄數(shù)據(jù)。

病斑分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]：0級(jí)，無病;1級(jí)，病斑面積占葉片面積的1/8以下;2級(jí)，病斑面積占葉片面積的1/8～1/4（不包括1/4）;3級(jí)，病斑面積占葉片面積的1/4～1/2（不包括1/2）;4級(jí)，病斑面積占葉片面積的1/2～3/4（不包括3/4）;5級(jí)，病斑面積占葉片面積的3/4及以上。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×病級(jí)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)值）×100;

防治效果=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.5 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效

將水稻種子（‘武粳21）浸泡24 h，置于25℃培養(yǎng)箱中保濕催芽，露白后播種于裝有滅菌泥土的塑料盆中，定期澆水，20 d后移栽于塑料桶中，每桶栽種3 穴，每穴3株。將菌株YU-1用 NB培養(yǎng)液，于28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，稀釋至OD600=1.0，備用。選取分蘗末期長勢(shì)一致的水稻植株，在等位置處以短牙簽梗嵌入法接入紋枯病菌餅（d=6 mm）。隨后噴霧菌株YU-1懸浮液，至葉片向下滴水為止。設(shè)置5個(gè)處理：NB培養(yǎng)液、YU-1菌懸液、NB培養(yǎng)液+紋枯病菌、YU-1懸浮液+紋枯病菌、0.005%申嗪霉素（有效成分1% 懸浮劑），每處理重復(fù)10次。每處理含有0.02%吐溫80表面活性劑。每7 d噴施1次，連續(xù)噴施2次，21 d后調(diào)查與記錄病斑長度。

按照0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄病害嚴(yán)重度[13]。0級(jí)：健康無病害;1級(jí)：病斑面積小于葉鞘面積的1/4;3級(jí)：病斑面積占葉鞘面積1/4～1/2（不包括1/2）;5級(jí)：病斑面積占葉鞘面積的1/2～3/4（不包括3/4）;7級(jí)：病斑面積大于等于葉鞘面積的3/4;9級(jí)：病斑到達(dá)植株頂部，所有葉片被嚴(yán)重侵染。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）×100;

防治效果=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.6 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)及形成的影響

1.6.1 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)的影響

將長勢(shì)一致的水稻紋枯病菌菌核置于生防菌YU-1發(fā)酵液（OD600=1.0）中浸泡1 h，在超凈工作臺(tái)中徹底風(fēng)干后轉(zhuǎn)接至PDA平板中，每皿4個(gè)菌核，以NB液體浸泡1 h為對(duì)照，每處理10次重復(fù)。28℃培養(yǎng)，每隔12 h測量并記錄菌核萌發(fā)形成菌落的直徑，以菌落直徑≥8 mm視為萌發(fā)，8 mm以下視為未萌發(fā)。

抑菌率=（對(duì)照菌核萌發(fā)數(shù)-處理菌核萌發(fā)數(shù)）/對(duì)照菌核萌發(fā)數(shù)×100%。

1.6.2 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核形成的影響

將菌株YU-1單菌落接種于30 mL NB 液體培養(yǎng)基中150 r/min， 28℃振蕩培養(yǎng)2 d，取適量細(xì)菌發(fā)酵液（OD600=1.0），10 000 r/min離心5 min，上清液用細(xì)菌濾膜（孔徑0. 22 μm）除菌，獲得無菌濾液，放于4℃冰箱備用。按1∶5，1∶10，1∶20的體積比例分別與PDA培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿制成平板。以無菌NB培養(yǎng)液為對(duì)照。將紋枯病菌菌餅（d=6 mm）接種于各處理平板中央，25℃培養(yǎng)，每處理10次重復(fù)。待7 d后用鑷子從平板中取出各處理形成的菌核，烘干，稱量干重。

1.7 菌株YU-1的鑒定

1.7.1 菌株YU-1的形態(tài)及生理生化特征

生理生化特征鑒定按東秀珠等方法進(jìn)行[14]。

1.7.2 菌株YU-1的分子鑒定

參照Lane的方法[15]，提取菌株YU-1的基因組DNA并對(duì)其16S rDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：模板 DNA 1.5 μL，引物（50 pmol/μL）各1 μL，TaqTM 1.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）2 μL，10× buffer 2 μL，dNTPs （10 mmol/μL）0.5 μL，加超純水補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 10 min;94℃變性 1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。gyrB特異性擴(kuò)增條件參照Yamamoto的方法[16]，引物為Up-1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′;Up2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNCRTCNGTCAT-3′。PCR產(chǎn)物測序由華大基因完成。用BLAST軟件將所得序列與GenBank中已報(bào)道的序列進(jìn)行同源性比較。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，采用SPSS 20.0對(duì)不同處理進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值采用Duncan氏新復(fù)極差法（Duncans new multiple range test）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻紋枯病生防菌株的分離

從湖北荊州采集水稻、甘藍(lán)、黃瓜、西瓜等根際土樣37份，采用土壤稀釋分離法，共分離獲得細(xì)菌297株，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 水稻紋枯病生防菌株的篩選

2.2.1 初篩

以水稻紋枯病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)，對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行初篩，結(jié)果如表1所示，從中可看出，菌株YU-1、YU-2、YU-3、YU-4對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌作用顯著，抑菌圈直徑在20 mm以上。

2.2.2 復(fù)篩

采用混藥平板法，將初篩抑菌圈直徑在20 mm以上的菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如圖1，表2所示，從中可看出，菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌落生長的抑制作用最為顯著，達(dá)89.8%。

2.3 菌株YU-1的抑菌譜測定

菌株YU-1對(duì)西瓜枯萎病菌、草莓灰霉病菌、番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌菌絲生長有明顯的抑制作用（圖2）。菌株YU-1對(duì)上述幾種病原真菌抑制率均在85%以上（表3）。

2.4 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的離體防效

菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的離體防效如表4和圖3所示，從中可看出：菌株YU-1對(duì)水稻葉片無致病作用，和申嗪霉素對(duì)水稻紋枯病均有較好的離體

防效，分別為73.1% 和71.4%。

2.5 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效

菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效結(jié)果如表5所示：菌株YU-1對(duì)水稻植株無致病作用，和申嗪霉素對(duì)水稻紋枯病均有較好的盆栽防效，分別為66.3%和64.7%。

2.6 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)及形成的影響

2.6.1 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)的影響

將水稻紋枯病菌菌核置于菌株YU-1發(fā)酵液中浸泡1 h，在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干后轉(zhuǎn)接至PDA平板中，以在NB液體中浸泡為對(duì)照。28℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察并計(jì)算菌核萌發(fā)抑制率，結(jié)果如表6所示：菌株YU-1在處理后48 h內(nèi)對(duì)水稻紋枯病菌菌核萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率均在92%以上。

2.6.2 菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核形成的影響

將菌株YU-1的無菌濾液按1∶5， 1∶10， 1∶20（V/V）分別與PDA 培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿，制成平板，以混入無菌NB培養(yǎng)液為對(duì)照。將紋枯病菌接入各處理平板中央，25℃培養(yǎng)，7 d后稱取菌核干重，計(jì)算相對(duì)抑制率，結(jié)果如表7和圖4所示：菌株YU-1對(duì)水稻紋枯病菌菌核形成具有一定的抑制作用，當(dāng)混合比例為1∶5時(shí)，相對(duì)抑制率可達(dá)62.8%。

2.7 菌株YU-1的鑒定

2.7.1 形態(tài)及生理生化特征

菌株YU-1在NA平板上菌落圓形，淡黃色，不透明，邊緣不規(guī)則，革蘭氏呈陽性，細(xì)胞形態(tài)桿狀，產(chǎn)芽胞，接觸酶和氧化酶反應(yīng)均為陽性。利用碳水化合物產(chǎn)酸試驗(yàn)：淀粉水解、水解酪素及水解明膠均為陽性，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，檸檬酸利用試驗(yàn)呈陽性。

2.7.2 分子鑒定

菌株YU-1的16S rDNA和gyrB序列片段大小分別為1 386 bp和1 259 bp，用BLAST軟件進(jìn)行相似性比較，與GenBank中核苷酸數(shù)據(jù)的對(duì)比結(jié)果表明菌株YU-1與解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens的相似性為100%。

3 討論

近些年，隨著矮桿多蘗品種的推廣，水稻密集型的栽培模式，以及氮肥施用量的不斷增加，水稻紋枯病的發(fā)生逐年加重，在我國稻區(qū)已成為危害最嚴(yán)重的病害之一?；瘜W(xué)藥劑的長期使用，不僅破壞生態(tài)環(huán)境，而且危害人類健康，科研工作者將研究方向轉(zhuǎn)向新型綠色生物農(nóng)藥的開發(fā)創(chuàng)制。

植物根際微生物數(shù)量龐大，種類繁多，有些微生物在促進(jìn)植物生長，提高植物抗病性中發(fā)揮重要功能。宋金秋等報(bào)道絞股藍(lán)的9株根際細(xì)菌都具有分泌IAA的能力，其中3株對(duì)獼猴桃致病菌丁香假單胞菌具有很好的抑菌作用[17]。本研究從水稻根際土壤中分離獲取的菌株YU-1能明顯抑制紋枯病菌的生長，同時(shí)對(duì)多種病原菌具有抑菌作用，在離體和盆栽中的防效分別為73.1%和66.3%，但是否具有促生作用有待進(jìn)一步研究。

菌核是水稻紋枯病的主要侵染源，在病害的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究中的菌株YU-1不僅能抑制菌核的萌發(fā)還能抑制菌核的形成，從來源上減少水稻紋枯病的發(fā)生。李松鵬等報(bào)道的兩株木霉菌株3S1-13和4S2-46發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病的防治效果均達(dá)到75%以上，本研究結(jié)果與其一致[18]。

已有研究結(jié)果表明，芽胞桿菌防治植物病害的作用機(jī)制主要包括拮抗作用，營養(yǎng)和生態(tài)位競爭，誘導(dǎo)植物抗病性[19]。張榮勝等報(bào)道解淀粉芽胞桿菌Lx-11對(duì)水稻植株的生長具有明顯的促進(jìn)作用，且促生長物質(zhì)主要存在于發(fā)酵上清液中[20]。程敏等報(bào)道解淀粉芽胞桿菌CGMCC 11640對(duì)核桃干腐病菌的抑菌率可達(dá)94.3%，其通過破壞病原菌菌絲和孢子細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)泄漏，導(dǎo)致菌絲和孢子萎縮，最終殺死病原菌細(xì)胞[21]。本研究分離獲得的解淀粉芽胞桿菌YU-1對(duì)水稻紋枯病菌具有拮抗作用，其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）