核桃細(xì)菌性黑斑病殺菌劑篩選及藥效研究

譙天敏　王麗　朱天輝

摘要 本文以黃單胞桿菌Xanthomonas campestris pv. juglandis （Pierce Dowson）為供試菌株，選用不同濃度的13種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明：有10種藥劑對該菌有一定的抑制效果，但只有5種殺菌劑能夠產(chǎn)生明顯的抑菌圈。其中，四霉素和鏈霉素的抑菌效果最強(qiáng)，最低抑菌濃度為0.165、3 μg/mL，抑菌率為74.76%、69.23%，EC50為12.764、35.318 μg/mL。其他依次為乙蒜素、中生菌素和春雷霉素。選用這5種殺菌劑進(jìn)行盆栽防治試驗，四霉素和鏈霉素的平均防效達(dá)74.60%、71.69%，乙蒜素和中生菌素防效分別為65.98%、58.40%，春雷霉素防效最低為39.38%。其結(jié)果與室內(nèi)基本一致。室內(nèi)試驗及盆栽試驗結(jié)果表明四霉素、鏈霉素、乙蒜素、中生菌素和春雷霉素可作為防治核桃黑斑病的殺菌劑，其中四霉素為首選殺菌劑。

關(guān)鍵詞 核桃; 細(xì)菌性黑斑病; 殺菌劑篩選; 防治效果

中圖分類號： S 763.13

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019226

Screening of bactericides and their control effect against

bacterial black spot disease of walnut

QIAO Tianmin， WANG Li， ZHU Tianhui*

（College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Wenjiang 611130， China）

Abstract

Using Xanthomonas campestris pv. juglandis （Pierce Dowson） as the tested strain， indoor virulence of 13 kinds of bactericides with different concentrations were determined. The results showed that 10 kinds of bactericides had certain inhibitory effects on the bacteria， but only 5 kinds could produce obvious inhibition zones. Among these bactericides， tetramycin and streptomycin had the strongest inhibition effect， with the minimum inhibitory concentration of 0.165 and 3 μg/mL， inhibition rate of 74.76% and 69.23%， and the EC50 values of 12.764 and 35.318 μg/mL， respectively， followed by ethylicin， zhongshengmycin and kasugamycin. Pot experiments of the five kinds of bactericides demonstrated that the average control efficacies of tetramycin and streptomycin were 74.60% and 71.69%， and those of ethylicin and zhongshengmycin were 65.98% and 58.40%， respectively， while kasugamycin was the weakest with the efficacy of 39.38%. The results showed that tetramycin， streptomycin， ethylicin， zhongshengmycin and kasugamycin could be used for controlling black spot of walnut， and tetramycin was the preferred bactericide.

Key words

walnut; bacterial black spot; screening of bactericide; control effect

核桃Juglans regia L.又稱為胡桃，波斯核桃、普通核桃和英國核桃，是胡桃科Juglandaceae、胡桃屬Juglans植物[1]。核桃仁中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及微量元素，具有較高的營養(yǎng)價值，被稱為“21世紀(jì)的超級食品”[2]。核桃中含有的脂肪酸、褪黑激素和抗氧化劑等具有較高的藥用價值，能夠幫助人類預(yù)防和減緩某些疾病的發(fā)生[3-4]。我國是核桃的原產(chǎn)地之一，其栽培歷史悠久，種植范圍廣泛，分布于全國大部分省區(qū)，主要集中于云南、四川、河北、山西等省。目前我國核桃種植面積、產(chǎn)量均占世界第一[5]。

隨著核桃種植面積的日益擴(kuò)大，核桃的病蟲害也日愈頻發(fā)[6-7]。核桃黑斑病作為核桃生產(chǎn)中的主要病害之一，為害核桃葉片、枝條和果實，嚴(yán)重影響核桃產(chǎn)量。核桃黑斑病病原菌為核桃黃單胞桿菌Xanthomonas campestris pv. juglandis （Pierce Dowson），屬黃極毛桿菌屬，是專性寄生核桃屬的病原細(xì)菌[8-9]。該病菌能夠侵染多種核桃，不同品種、類型、樹齡、樹勢的植株發(fā)病程度均不相同。一般來講，健壯樹種低于病弱樹，中幼齡樹低于老樹，有蟲害發(fā)生的植株或地區(qū)發(fā)病較嚴(yán)重[10]。樹冠稠密茂盛，通風(fēng)透光性差，定植密度過大的園區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。核桃黑斑病的發(fā)生及發(fā)病程度與溫度濕度關(guān)系密切，高溫高濕是該病發(fā)生的首要條件，在多雨年份發(fā)病早并且嚴(yán)重。核桃細(xì)菌性黑斑病主要危害核桃果實、葉片、嫩梢、芽及枝條[11-12]。葉片受害，首先在葉脈處出現(xiàn)近圓形或多角形小黑斑，嚴(yán)重時病斑擴(kuò)展，外圍有水漬狀暈圈，少數(shù)病葉出現(xiàn)穿孔，提早脫落。幼果受害后，在果面上出現(xiàn)黑褐色小斑點，無明顯邊緣，以后逐漸擴(kuò)大成近圓形或不規(guī)則形、漆黑色病斑并下陷，外圍有水漬狀暈圈。果實由外向內(nèi)腐爛，常稱之為“核桃黑”[13-14]。核桃黑斑病的發(fā)生嚴(yán)重影響了核桃的生長和產(chǎn)量。為減少核桃細(xì)菌性黑斑病對核桃生長、生產(chǎn)的危害，需找到抑菌有效濃度最低的藥劑進(jìn)行防治，以控制該病害的發(fā)生及流行，減少核桃產(chǎn)量損失，提高核桃質(zhì)量。本試驗采用含毒介質(zhì)法和抑菌圈法對幾種抗生素類及常用化學(xué)藥劑進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選，并將室內(nèi)篩選出的藥劑進(jìn)行盆栽藥效試驗，得到了一批對核桃細(xì)菌性黑斑病殺菌效果較好的藥劑，為今后核桃黑斑病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試菌株，核桃黃單胞桿菌X.campestris pv. juglandis （Pierce Dowson），由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實驗室分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

核桃黃單胞桿菌活化及發(fā)酵培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基[9]。

1.3 供試殺菌劑

本研究共選用13種殺菌劑，劑型和來源見表1。

1.4 不同藥劑最低抑菌濃度測定

采用含毒介質(zhì)法[15]。將供試的農(nóng)藥配制成濃度為50 mg/mL的液體藥劑，供試的醫(yī)學(xué)用途抗生素配制為10 mg/mL的溶液。待滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基溫度降至55℃左右時，向含有100 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶中加入按照濃度換算的一定體積藥液，稀釋成6種不同濃度的含藥培養(yǎng)基，劃線接種黃單胞桿菌，每處理重復(fù)3次。以未加藥劑的培養(yǎng)基接種病原菌作空白對照。接菌平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。未能辨別出接菌點或有接菌點但干縮的，為菌落生長受抑制，用“-”表示，接菌點能夠生長并保持濕潤，無論菌落直徑大小都表示菌落可以生長，用“+”表示。

記錄每種藥劑在每個濃度下菌落的生長情況，將菌落剛剛能生長的藥劑濃度標(biāo)記為C+，菌落不能生長的最低藥劑濃度標(biāo)記為C-，根據(jù)公式C′=（C++C-）/2，計算每次試驗中的最低抑菌濃度C′，通過3次重復(fù)試驗結(jié)果計算最低抑菌濃度的平均值C=（C1′+C2′+C3′）/3。

1.5 不同藥劑毒力測定

采用抑菌圈法[16]。將1.4篩選出來的藥劑配制成5個濃度梯度（最低濃度要高于該藥劑的最低抑菌濃度）。挑取兩環(huán)活化24 h的X.campestris pv. juglandis菌落于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，于30℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h后用血球計數(shù)板將菌懸液濃度調(diào)節(jié)到約3×108cfu/mL，待滅菌的NA瓊脂培養(yǎng)基溫度降至55℃左右時，迅速將10 mL配制好的菌懸液倒入培養(yǎng)基混合均勻，再將含菌培養(yǎng)基快速倒入多個滅菌的培養(yǎng)皿中備用。待培養(yǎng)基凝固，用直徑為8 mm的打孔器在培養(yǎng)基上按3個不同的方向等距離打孔，向孔中分別注入相同濃度100 μL的藥液，每處理重復(fù)3次，以注入無菌水的作為空白對照。每種藥劑按此方法做6個濃度梯度。將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～60 h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算不同濃度的藥劑產(chǎn)生的抑菌圈平均值，建立藥劑的毒力回歸方程，計算各藥劑EC50，以EC50來衡量藥劑對病原菌的毒力強(qiáng)弱[17]。

抑菌率=（處理組抑菌圈直徑-對照組抑菌圈直徑）/處理組抑菌圈直徑×100%[18]。

1.6 盆栽防效試驗

盆栽試驗的核桃苗品種為‘香玲，樹齡2年。選擇長勢相同的核桃盆栽苗，以針刺法接種核桃黃單胞桿菌，待其感病后進(jìn)行防效試驗[19]。選用室內(nèi)篩選出的抑菌效果最好的5種殺菌劑對感染黑斑病的核桃苗進(jìn)行防治。利用微型噴霧器對每株核桃葉片進(jìn)行正反面噴霧，使著藥均勻。每種藥劑設(shè)3個濃度，每個濃度處理5株核桃苗，重復(fù)3次，設(shè)置清水為空白對照，各處理組分隔培養(yǎng)以避免交叉影響。接種后保濕48 h。施藥時間在5月中旬到6月中旬，每隔7 d噴1次，共噴3次。于每次噴藥前1 d和噴藥后的第7天調(diào)查核桃黑斑病的發(fā)病程度、記錄每片葉子的病情等級，計算病情指數(shù)和防治效果[20]。確定盆栽試驗中防治效果最好的殺菌劑。病級分為0～Ⅴ級，代表值為0～5，分別代表病斑面積占葉片面積0%（未發(fā)?。?、10%以下、10%～20%、21%～50%、51%～80%、80%以上。

病情指數(shù)=[∑（各級病葉數(shù)×該級代表值）/調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值]×100;

防治效果=1-（藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)×對照區(qū)施藥前病情指數(shù)）/（對照區(qū)施藥后病情指數(shù)×藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)）×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20和Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計和分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑最低抑菌濃度測定結(jié)果

本試驗共選用了13種藥劑，其中50%多菌靈WP、75%百菌清WP、70%甲基硫菌靈WP對X.campestris pv. juglandis完全沒有抑制作用，另外10種藥劑對其有較好的抑制作用且抑制效果有很大的差異（表2）。0.3%四霉素AS對黃單胞桿菌的抑制作用最強(qiáng)，其最低抑菌有效濃度為0.165 μg/mL。鏈霉素WP的抑制作用也非常明顯，其最低抑菌有效濃度為3 μg/mL。其次是80%乙蒜素EC和12%中生菌素WP，它們的最低抑菌有效濃度分別為7.5 μg/mL和9 μg/mL。2%春雷霉素AS和72%硫酸鏈霉素WP對黃單胞桿菌也有較強(qiáng)的抑菌效果，其最低抑菌有效濃度分別為125 μg/mL和288 μg/mL。80%代森鋅、80%波爾多液WP和8%寧南霉素AS都具有一定的抑菌效果。80%代森錳鋅WP的抑菌效果最差，其最低抑菌有效濃度為1 320 μg/mL，因而不適宜生產(chǎn)應(yīng)用。

2.2 不同藥劑毒力測定結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，有5種藥劑出現(xiàn)明顯的抑菌圈。其中0.3%四霉素AS抑菌圈清晰度和透明度最高，且隨著藥劑濃度的增加其直徑也逐漸增大，表明抑菌效果也隨之加強(qiáng)。濃度為25 μg/mL時，抑菌圈直徑為18 mm，抑菌率為55.56%;當(dāng)濃度增加到250 μg/mL時，抑菌圈直徑為31.7 mm，其抑菌率高達(dá)74.76%。鏈霉素WP和80%乙蒜素EC的抑菌圈清晰度和透明度較高，抑菌圈直徑較大，抑菌效果也較為明顯，抑菌率分別達(dá)69.23%、66.25%。2%春雷霉素AS和12%中生菌素WP抑菌圈清晰度和透明度一般，抑菌圈直徑相對較低，抑菌效果也相對較差。其他5種藥劑，72%硫酸鏈霉素WP、8%寧南霉素AS、80%波爾多液WP、80%代森鋅WP、80%代森錳鋅WP均未出現(xiàn)抑菌圈。

試驗結(jié)果表明本次抑菌效果試驗所得數(shù)據(jù)誤差較小。這5種藥劑在不同程度上抑制了核桃黑斑病病原菌的正常生長。0.3%四霉素AS、鏈霉素WP對核桃黑斑病的抑菌效果最好，EC50最小，分別為12.764 μg/mL和35.318 μg/mL;其次是80%乙蒜素EC和12%中生菌素WP，其EC50分別296.483 μg/mL和350.752 μg/mL;2%春雷霉素AS的抑菌效果最差，其EC50為1 399.59 μg/mL（表3）。以上計算所得的EC50與通過測量抑菌斑直徑所得的各藥劑抑菌程度大致相同。試驗數(shù)據(jù)分析中，斜率b表示敏感度，卡方值表示理論抑菌率與實際抑菌率的偏差程度，卡方值越大表示實際偏離理論的程度越大。由表3可見，5種農(nóng)藥卡方值均較小，實際抑菌率與理論抑菌率偏差小，5種農(nóng)藥試驗所得P值均大于0.05，說明數(shù)據(jù)可信。

2.3 盆栽試驗結(jié)果

根據(jù)室內(nèi)毒力試驗篩選出了5種防效良好的藥劑進(jìn)行盆栽藥效試驗，結(jié)果（表4）表明，經(jīng)過不同濃度配比后的5種藥劑施用后病情指數(shù)均表現(xiàn)下降趨勢，與對照相比變化趨勢顯著。供試藥劑防效隨稀釋倍數(shù)增加而降低，隨施藥次數(shù)增加而增加。第1次施藥后，0.3%四霉素AS 500倍液和鏈霉素WP 1 000倍防效最好，分別達(dá)66.28%、65.97%，隨著稀釋倍數(shù)的增加兩種藥劑的防效也相應(yīng)降低，差異較為顯著;80%乙蒜素EC和12%中生菌素WP的防效相對較差，防效分別為61.26%、56.81%;2%春雷霉素AS防效最差，為41.99%。第2次施藥后，0.3%四霉素AS 500倍液防效最好，為75.91%，其他4種藥劑的防效分別為72.53%、66.82%、58.66%、39.68%。第3次施藥后，0.3%四霉素AS 500倍液防效可達(dá)81.61%，其他4種藥劑的防效為76.57%、69.87%、59.73%、36.47%。從平均防效來看，0.3%四霉素AS 500倍液防治效果最好，平均防效為74.6%。鏈霉素WP 1 000倍液防治效果次之，平均防效為71.69%。2%春雷霉素AS防治效果最差，平均防效最高僅為39.38%?？偟膩碇v，0.3%四霉素AS和鏈霉素WP各個濃度的防治效果優(yōu)于其他藥劑。0.3%四霉素AS是防治核桃黑斑病的高效化學(xué)藥劑。該結(jié)果與室內(nèi)藥劑篩選試驗結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

核桃細(xì)菌性黑斑病是核桃樹的主要病害之一，對核桃的生長和生產(chǎn)有巨大的影響。由于其危害較為嚴(yán)重，因此其防治技術(shù)一直備受關(guān)注，但研究主要集中在病害發(fā)生后的防治措施、及田間藥效試驗，關(guān)于室內(nèi)藥劑毒力測定的文獻(xiàn)極少。因此，本文首先進(jìn)行了關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病菌室內(nèi)藥劑篩選的試驗，從而確定出抑菌效果顯著的藥劑。然后，根據(jù)室內(nèi)篩選結(jié)果進(jìn)行盆栽防治試驗，篩選出能夠有效防治核桃黑斑病的殺菌劑。

本研究選用了鏈霉素WP、0.3%四霉素AS、80%乙蒜素EC、80%波爾多液WP等13種藥劑，采用含毒介質(zhì)法中的最低抑菌濃度法，測定各殺菌劑對核桃細(xì)菌性黑斑病菌的最低抑菌濃度。結(jié)果顯示，50%多菌靈WP、75%百菌清WP、70%甲基硫菌靈WP對X.campestris pv. juglandis完全沒有抑制作用，原因可能是這些藥劑多針對真菌有效，因而難以起到抑制病原細(xì)菌的效果。另外10種藥劑對其有很好的抑制作用，并且對X.campestris pv. juglandis所表現(xiàn)出來的抑制效果有很大的差異。0.3%四霉素AS、鏈霉素WP、80%乙蒜素EC和12%中生菌素WP的抑菌效果最強(qiáng)，其最低抑菌濃度分別為0.165、3、7.5、9 μg/mL。

毒力回歸方程中的EC50的大小可以反映出殺菌劑抑菌效果的優(yōu)劣，EC50越低，該殺菌劑的抑菌作用就越強(qiáng)，對病原菌生長抑制效果越佳。本研究中，0.3%四霉素AS、鏈霉素WP、80%乙蒜素EC、12%中生菌素WP和2%春雷霉素AS能夠產(chǎn)生較為明顯的抑菌圈，另外5種藥劑并未出現(xiàn)抑菌圈。其中，0.3%四霉素AS抑菌圈最明顯，透明度和清晰度也最高，其抑菌率達(dá)74.763%，EC50最小，對供試病原菌的抑制作用優(yōu)于其他藥劑。一般而言，藥劑濃度與防治效果正相關(guān)，而與各藥劑的病情指數(shù)負(fù)相關(guān)，可見，使用不同濃度藥劑進(jìn)行防治可以直接表現(xiàn)其防治效果優(yōu)劣。將室內(nèi)篩選出的5種藥效較好的殺菌劑配成不同濃度分別作用于盆栽試驗。結(jié)果表明：0.3%四霉素AS防治效果最好，第3次施藥后防效達(dá)81.61%，室內(nèi)毒力試驗與盆栽試驗結(jié)果表明，0.3%四霉素AS是防治核桃細(xì)菌性黑斑病的理想藥劑。該結(jié)果同劉寶生等[21]研究幾種生物藥劑對核桃黑斑病的田間防效試驗結(jié)果相同。

四霉素是一種高效、低毒的微生物源農(nóng)藥，對靶標(biāo)作物安全，對環(huán)境影響小，是一種新型的殺菌劑。四霉素制劑含有4種活性組分，分別是A1，A2，B和C。A1和A2組分為大環(huán)內(nèi)酯類四烯抗生素，B組分為肽類抗生素，C組分為含氮雜環(huán)芳香族抗生素茴香霉素。其中四烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素在細(xì)菌性病害的防治過程中有著至關(guān)重要的作用[22]。同時，四霉素能夠通過誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶（PAL），過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性來增加植物的抗病性[23-24]。因此，在核桃黑斑病防治試驗中，四霉素表現(xiàn)出的防效最強(qiáng)。鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，是一種微生物源殺細(xì)菌劑，對多數(shù)農(nóng)作物病原菌具有毒殺作用，另外還可以通過內(nèi)吸作用進(jìn)入植物體內(nèi)，經(jīng)過植物的維管系統(tǒng)到達(dá)各個部位，對病原菌產(chǎn)生殺傷作用。本次試驗結(jié)果顯示，鏈霉素能夠有效防治核桃細(xì)菌性黑斑病，同王瀚等[25]對核桃黑斑病抑菌活性測定試驗結(jié)果吻合。乙蒜素是一種植物仿生農(nóng)藥，對細(xì)菌性病害有較好防效[26]，本試驗結(jié)果表明，80%乙蒜素EC對核桃細(xì)菌性黑斑病的防治效果較為顯著，同羅小妹[27]的田間試驗結(jié)果基本一致。中生菌素是一種廣譜保護(hù)性殺菌劑，具有觸殺、滲透作用。中生菌素對細(xì)菌性病害及部分真菌性病害具有很高的活性。本結(jié)果顯示12%中生菌素WP對核桃細(xì)菌性黑斑病的防治效果一般，同劉寶生等[21]的田間防效試驗結(jié)果有一定的差異。2%春雷霉素AS對核桃黑斑病防治作用不明顯。

通過試驗結(jié)果分析，0.3%四霉素AS可作為防治核桃細(xì)菌性黑斑病的首選藥劑，在今后的田間試驗可以優(yōu)先使用，并根據(jù)田間的實際生產(chǎn)需要來確定最佳濃度、噴施次數(shù)以及噴施時間。相關(guān)研究表明，若長期對林木病害使用同一種藥劑，病原菌可能會對其產(chǎn)生耐藥性，因此有必要科學(xué)合理地使用殺菌劑。防治時可選擇0.3%四霉素AS、鏈霉素WP、80%乙蒜素EC和12%中生菌素WP交替輪換使用。還可以使用相關(guān)藥劑的復(fù)配藥品制劑，以減緩抗藥性的產(chǎn)生，提高防治效果。當(dāng)然，除了藥劑防治外，選育和栽培抗病品種、確定合理栽植密度、病枝修剪和清除菌源等措施對核桃細(xì)菌性黑斑病的防控也是非常必要的。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）