臭節(jié)草化學(xué)成分預(yù)試及生物堿成分薄層色譜分析

李劍美，李學(xué)玲，周仕順，王桃林，陶 川，，趙 鋒*

（1.云南省高校民族醫(yī)藥資源研究東南亞國際合作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000；2.云南省高校亞熱帶藥用食用資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000；3.普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000；4.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303）

臭節(jié)草 （Boenninghausenia albiflora（Hook.）Reichb）為蕓香科 （Rutaceae）石椒草屬 （Boenninghausenia）的多年生草本植物［1］。《全國中草藥匯編》中記載臭節(jié)草以全草作藥，味辛、苦，性溫或寒，具有清熱、散瘀、涼血、舒筋、消炎的作用，可治風(fēng)寒感冒、咽喉炎、腮腺炎、支氣管炎、皮下瘀血等，又作驅(qū)蟲藥［2］。普洱地區(qū)將臭節(jié)草稱之為貓腳跡、白虎草，當(dāng)?shù)孛褡迕耖g醫(yī)生以其根或全草入藥，主治感冒發(fā)燒，消炎，支氣管炎，消化不良，跌打，瘡瘍潰膿。國內(nèi)外學(xué)者研究了與臭節(jié)草同科同屬的石椒草的化學(xué)成分和藥理作用，發(fā)現(xiàn)石椒草植物的化學(xué)成分主要含有香豆素類和生物堿化合物，還含有黃酮、芳香油和谷甾醇類化合物［3-4］；在藥理方面其具有抗菌、解痙和鈣通道抑制的作用，其自身也能分泌某些物質(zhì)，能阻止有害昆蟲對其宿主植物造成的傷害［5-9］。石椒草屬植物共有2種及1變種，分別為石椒草、臭節(jié)草和毛臭節(jié)草，其中以石椒草研究較為廣泛，相對于民間普遍使用的臭節(jié)草則無論是化學(xué)成分、藥理活性和臨床研究均較少。中華民族醫(yī)藥資源豐富，很多植物和動(dòng)物的藥材都未能建立起完整的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，因此采用化學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法了解其所含的類型成分，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于民間或者民族一些常用、療效較好的藥材的篩選研究［10-16］。

1 材料與儀器

1.1 材料

臭節(jié)草采集于云南省寧洱縣普義鄉(xiāng) （海拔1600m左右）樹林下，經(jīng)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園標(biāo)本館鑒定為蕓香科石椒草屬臭節(jié)草Boenninghausenia albiflora（Hook.）Reichb。取一定量的臭節(jié)草藥材風(fēng)干粉碎，過60目篩，密封保存。

1.2 試劑

95%乙醇、石油醚 （60～90℃）、氨水、氫氧化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、冰醋酸、醋酐、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、醋酸酐和無水乙醇均為分析純。其他試劑 （雙縮脲試劑、10%α-萘酚乙醇液、斐林 （Fehling）試劑、三氯化鐵試劑、溴甲酚綠試劑、碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑、碘-碘化鉀試劑、三氯化鋁試劑、醋酸鎂試劑等）均自配。

1.3 儀器

藥材粉碎機(jī) （DFT-50A）、電子天平（FA3204B）、數(shù)控超聲波清洗器 （BK-360C）、電熱恒溫水浴鍋 （HH-6A）、三用紫外儀 （ZF-1）。

2 方法

2.1 化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)供試液的制備

由于各種類型的化學(xué)成分在不同溶劑中的理化性質(zhì)不同，因此樣品提取液包括水提取液、乙醇提取液、酸性乙醇提取液和石油醚提取液。

2.1.1 水提取液

稱取樣品粗粉10g，浸于100mL蒸餾水中過夜后，放入60℃水浴中加熱1h，過濾，得熱水提取液，濾液供檢查多糖、有機(jī)酸、皂甙等成分。

2.1.2 乙醇提取液

稱取樣品粗粉10g，加95%乙醇100mL，水浴加熱回流1h，稍冷后加少量蒸餾水，冷至室溫，過濾，濾液分別用50mL石油醚 （60～90℃）萃取兩次，分出下層乙醇提取液，濃縮至40～50mL，加95%乙醇50mL溶解后過濾，濾液供檢查黃酮、蒽醌等成分。

2.1.3 酸性乙醇提取液

稱取樣品粗粉5g，加10mL 0.5%硫酸的乙酸溶液，水浴加熱回流10min，過濾，濾液供檢查生物堿用。

2.1.4 石油醚提取液

稱取樣品粗粉 1g，加入石油醚 （60～90℃）10mL，濾液供檢查揮發(fā)油、油脂、萜類、甾體化合物等成分用。

2.2 預(yù)試方法

采用 《天然藥物化學(xué)》和 《中藥化學(xué)》介紹的傳統(tǒng)試管預(yù)試方法進(jìn)行［17-18］。

2.3 臭節(jié)草TLC分析方法

2.3.1 臭節(jié)草總浸膏的制備

分別稱取臭節(jié)草莖、葉和根的粗粉5g，加入30mL濃氨水浸潤16 h，再加入30mL氯仿超聲提取1h，減壓過濾，濾液水浴揮干，得樣品殘?jiān)?/p>

2.3.2 臭節(jié)草生物堿的分段提取

將2.3.1的殘?jiān)?.6%HCl超聲溶解，過濾，濾液用濃氨水調(diào)pH9-10，用氯仿萃取3次，每次10mL，合并氯仿，水浴揮干，再用1mL氯仿溶解，得供試品溶液。

2.3.3 臭節(jié)草生物堿薄層層析檢查

取上述供試品溶液毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠GF254板，采用經(jīng)氯仿 -甲醇 （9∶1）、苯 -乙醇 （8∶2）、環(huán)己烷-二乙胺 （9∶1）、氯仿-丙酮-氨水 （50∶20∶0.3）4種展開劑展開，再用改良碘化鉍鉀試劑顯色，于紫外燈365nm下檢視。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各類成分特有的化學(xué)反應(yīng)如顏色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)等做一般定性預(yù)實(shí)驗(yàn)，從而得知供試品溶液中可能含有的化學(xué)成分類型。結(jié)果見表1～表4。

表1 臭節(jié)草水提取液成分預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 臭節(jié)草乙醇提取液成分預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表3 臭節(jié)草酸性乙醇提取液成分預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表4 臭節(jié)草酸性乙醇提取液成分預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

3.2 臭節(jié)草生物堿提取分離結(jié)果

臭節(jié)草生物堿提取分離結(jié)果見表5。

表5 臭節(jié)草生物堿提取分離結(jié)果

臭節(jié)草地上部分和地下部分經(jīng)濃氨水浸潤和氯仿超聲提取得總浸膏分別為0.5792g和0.4953g，出膏率分別為11.58%和9.90%，所得總浸膏經(jīng)酸化、堿化處理，再經(jīng)氯仿萃取得到生物堿提取物，分別為0.0921g和0.0784g，生物堿的粗提取率約為1.8%和1.6%。

3.3 臭節(jié)草生物堿薄層分析結(jié)果

臭節(jié)草生物堿氯仿萃取部分經(jīng)氯仿-甲醇 （9：1）、苯 -乙醇 （8∶2）、環(huán)己烷 -二乙胺 （9∶1）、氯仿-丙酮-氨水 （50∶20∶0.3）4種展開劑展開，用改良碘化鉍鉀試劑顯色。結(jié)果表明 （見表6），用氯仿-丙酮-氨水 （50∶20∶0.3）展開的效果最好，顯色斑點(diǎn)圓滑，不拖尾；臭節(jié)草的莖葉和根分別有6個(gè)和4個(gè)顯色斑點(diǎn) （見圖1），其余三個(gè)展開系統(tǒng)未見明顯斑點(diǎn)。

表6 臭節(jié)草生物堿莖葉氯仿萃取薄層層析檢查結(jié)果（改良碘化鉍鉀顯色）

圖1 臭節(jié)草地上部分 （J）和地下部分 （G）生物堿薄層層析檢查結(jié)果 （365nm）

4 討論

4.1 關(guān)于臭節(jié)草化學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)

通過系統(tǒng)的化學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)，提示臭節(jié)草中可能含有生物堿、有機(jī)酸、甙類、黃酮、和還原糖等。其中以還原糖類和生物堿類的反應(yīng)比較明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的同屬植物石椒草中主要含有的生物堿類物質(zhì)一致［19-22］。臭節(jié)草所含的這些化學(xué)成分具有多種生理活性和應(yīng)用前景，例如，黃酮類化合物是治療心血管系統(tǒng)疾病的重要藥物，還具有保肝、抗菌、抗病毒、解痙等作用［23］；多數(shù)生物堿具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒以及抗血小板凝集、抗心律失常和抗高血壓等心血管疾病的作用。所以，它在衛(wèi)生、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛能［24］。

4.2 關(guān)于臭節(jié)草主要化學(xué)成分的分析

本試驗(yàn)在對臭節(jié)草化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對反應(yīng)比較顯著的生物堿和糖類分別采用TLC分析檢測其大致所含的生物堿種類和采用蒽酮比色法測定了總糖的含量。篩選出了臭節(jié)草生物堿最適宜的展開劑為氯仿∶丁酮∶氨水 （50∶20∶0.3），初步觀察到臭節(jié)草地上和地下部分6種和4種生物堿，所得的生物堿粗提取率分別為1.8%和1.6%，測得總糖含量為5.57%和3.55%。通過對臭節(jié)草不同部位生物堿初試和總糖的測定，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為臭節(jié)草得的開發(fā)利用提供參考，得出臭節(jié)草具有一定的開發(fā)利用價(jià)值。然而臭節(jié)草作為藥用植物，其生物堿和糖類是否具有抑菌抗炎等效果有待進(jìn)一步的研究。