供精人工授精助孕患者人乳頭瘤病毒感染情況及妊娠結(jié)局分析

王莉莉，郝偉明，史雅萍，郅洋，李艷梅，梁云霞，張曉花，宋海霞，姬英英，郭興萍

(山西省生殖科學(xué)研究所生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030006)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)屬乳多空病毒科，目前已鑒定出多種亞型。臨床上根據(jù)HPV的侵染偏好及致癌性，將其分為高危型、疑似高危型及低危型[1]。其中高危型感染除與生殖道疣、鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)有關(guān)，更與女性宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[1-2]。HPV在女性育齡人群中的攜帶率較高(約為10%)，性傳播及密切生活接觸是其主要的傳播途徑[3]。

近年來國內(nèi)外有文獻(xiàn)報道了HPV感染對育齡人群生育力的影響[4-5]，但對接受輔助生殖技術(shù)(ART)治療的不孕不育人群的感染情況及其對妊娠結(jié)局影響的報道仍較少，尤其是供精人工授精(artificial insemination by donor，AID)助孕患者。本研究回顧了近5年來在山西省生殖科學(xué)研究所生殖醫(yī)學(xué)中心接受AID治療的女性患者HPV感染情況，并通過歸納分析探究HPV感染對AID妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2019年6月在本所生殖醫(yī)學(xué)中心接受AID治療的824例女性患者的1 834個AID治療周期的病例資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：男方因素導(dǎo)致的不育，包括：不可逆的無精子癥(如先天性無睪丸、隱睪、輸精管缺如)、嚴(yán)重少弱畸精子癥、不宜生育的嚴(yán)重遺傳性疾病等；女方至少一側(cè)輸卵管暢通；無排卵障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：女方高齡(>40歲)；子宮內(nèi)膜炎、治療過程中出現(xiàn)中重度盆腔炎癥等；內(nèi)分泌異常，如基礎(chǔ)性激素水平、甲狀腺功能異常等。根據(jù)女方HPV感染情況，將上述研究對象分為兩組：HPV陽性組共85例(184個周期)與HPV陰性組共739例(1 650個周期)。接受AID治療前，夫婦雙方均知情同意并簽署相關(guān)知情同意書。

二、研究方法

1.HPV檢測：進(jìn)入治療周期前的1個月內(nèi)進(jìn)行檢測。檢測方法為PCR-反向點(diǎn)雜交法。檢測的HPV型別有：高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59型)、疑似高危型(53、66、68、73、82、83型)和低危型(6、11、42、43、81型)。采用專門的宮頸脫落細(xì)胞采集器進(jìn)行采樣，采樣后對含脫落細(xì)胞的宮頸黏液進(jìn)行處理，提取HPV DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物雜交、洗膜、顯色等步驟后，通過膜條上各探針區(qū)域的顯色情況判讀受檢者的HPV感染情況。所用檢測試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供，所有操作全部按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

2.治療方案：根據(jù)女方排卵情況，選擇自然周期或卵巢微刺激方案。卵巢微刺激方案主要包括氯米芬(CC，高特制藥，塞浦路斯)/人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG，珠海麗珠制藥)+人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠制藥)或CC+HMG+HCG方案。一般自月經(jīng)第10天左右開始，通過陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，直至優(yōu)勢卵泡破裂。

3.供精精液選擇及處理：所用的供精精液全部來自于山西省人類精子庫。依據(jù)“血型一致(即供精者與男方患者血型一致)”、“1∶5(即每位供精者精液最多只能使5名女性受孕)”、“每周期使用同一供精者精液”的原則，為患者隨機(jī)分配精液(1 ml×2支)?；颊咄馐褂煤?，將裝在凍存管中的精液從液氮中取出，置于37℃水浴箱中復(fù)蘇10 min。復(fù)蘇后通過雙層密度梯度離心法進(jìn)行處理。處理后精子懸液體積調(diào)至0.5～0.6 ml。

4.人工授精：分為排卵前、后雙次授精和排卵后單次授精。雙次授精：當(dāng)B超顯示優(yōu)勢卵泡未破但患者尿LH呈陽性，或者人工注射HCG后的當(dāng)日(一般為HCG后3 h內(nèi))行第1次授精，待B超確認(rèn)卵泡破裂后行第2次授精；單次授精：B超確認(rèn)優(yōu)勢卵泡破裂后的24 h內(nèi)，將2支精液同時處理后進(jìn)行授精。人工授精后均給予黃體支持(地屈孕酮10 mg/次，2次/d，口服2周)。

5.妊娠確認(rèn)：患者于人工授精術(shù)后的第14天來院抽血化驗β-HCG，確定生化妊娠情況；第35天來院行B超檢查，確定臨床妊娠情況，并于孕18周繼續(xù)來院檢查，明確胎兒發(fā)育情況。

6.觀察指標(biāo)：(1)患者一般情況：女方年齡、HPV感染情況、不孕類型及不孕年限、治療方案、實(shí)施周期數(shù)；(2)治療相關(guān)參數(shù)：優(yōu)勢卵泡數(shù)、處理前后精子濃度與前向運(yùn)動精子比例、授精日子宮內(nèi)膜厚度、授精方式；(3)周期妊娠結(jié)局：臨床妊娠率、生化妊娠率、流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、HPV感染情況

納入研究的824例女性患者中HPV感染者85例，占10.3%；HPV未感染者739例，占89.7%。其中70例為單一型感染，15例為多型混合感染。單一型感染中高危型(包括疑似高危型)感染60例，占總感染數(shù)的70.6%；低危型感染10例，占總感染數(shù)的11.8%?；旌细腥局校呶Ｐ透腥?1例，占總感染數(shù)的12.9%，其中大部分為2個型別的感染，少數(shù)為3個及3個以上型別的感染，另有4例為低危型與高危型的混合感染，占總感染數(shù)的4.7%。高危型中，感染率最高的為16型(17/85，20.0%)，另一常見高危型18型的感染率較低(3/85，3.5%)，不常見的高危型51型(9/85，10.6%)、52型(12/85，14.1%)、58型(9/85，10.6%)和疑似高危型53型(9/85，10.6%)的感染率較高；低危型中，主要涉及的型別有6型(3/85，3.5%)、42型(5/85，5.9%)和81型(5/85，5.9%)等，其中42和81型檢出率最高，未發(fā)現(xiàn)2種及以上低危型的混合感染。

二、兩組患者一般資料及治療情況比較

除HPV感染情況外，AID患者涉及的其它可能影響妊娠結(jié)局的重要因素有：女方年齡、不孕年限、不孕類型、治療方案、實(shí)施周期數(shù)、平均優(yōu)勢卵泡數(shù)、授精次數(shù)、精液指標(biāo)、子宮內(nèi)膜情況等。經(jīng)t檢驗及χ2檢驗，以上各參數(shù)在HPV陰性組及HPV陽性組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料及治療情況比較[(-±s)，%]

三、兩組患者AID妊娠結(jié)局比較

納入研究的1 834個AID周期中，HPV陰性組患者實(shí)施周期數(shù)為1 650個，HPV陽性組患者實(shí)施周期數(shù)為184個，HPV陽性組臨床妊娠率和總流產(chǎn)率略高于HPV陰性組，尚無顯著性差異(P>0.05)；按照流產(chǎn)時間進(jìn)行細(xì)分后，HPV陽性組晚期流產(chǎn)率顯著高于HPV陰性組(P<0.05)，早期流產(chǎn)率及其它妊娠結(jié)局指標(biāo)兩組間比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

人類ART運(yùn)用至今，已發(fā)展到胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)乃至卵胞漿置換技術(shù)的階段，但人工授精術(shù)以其操作簡便、幾乎無創(chuàng)、費(fèi)用較低等優(yōu)勢，仍然是臨床首選的一線助孕方案[6]。尤其是上世紀(jì)80年代末，人類精子庫和AID技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，解決了不可逆性無精子癥和嚴(yán)重染色體異常等問題患者的合法生育需求。目前人工授精的周期臨床妊娠率一般在10%～20%之間，且受諸多因素影響[7-8]。研究已證實(shí)其主要影響因素有：女方年齡、不孕年限、治療方案、排卵情況(優(yōu)勢卵泡數(shù))、精子質(zhì)量(活力、濃度)等[7-9]。此外，子宮內(nèi)膜情況、授精時機(jī)及次數(shù)、病原體感染情況等作為臨床妊娠率的潛在影響因素也有報道，但結(jié)論并不一致[10-12]。

目前納入人工授精術(shù)前常規(guī)檢查的病原體檢查項目有解脲支原體、沙眼衣原體、優(yōu)生十項(TORCH)、HBV、HCV、HIV、梅毒、淋球菌等。關(guān)于這些病原體對人工授精妊娠結(jié)局影響的研究報道較少。與之相比，HPV雖未被列入人工授精術(shù)前的必查項目，但其對人工授精、體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠結(jié)局都有顯著的不利影響。Depuydt等[13]通過對590名女性的1 529個夫精人工授精(AIH)周期的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，HPV感染者的臨床妊娠率約為未感染者的1/6(1.87% vs.11.36%，P=0.004 1)；2019年，Depuydt等[14]又通過對877個AIH周期和485個AID周期的回顧性分析，再次確認(rèn)HPV感染可導(dǎo)致人工授精臨床妊娠率顯著下降。Garolla等[15]亦研究發(fā)現(xiàn)HPV感染可明顯降低人工授精與IVF-ET的活產(chǎn)率并增加流產(chǎn)率。一些系統(tǒng)評價與meta分析也得出相似結(jié)論[4-5，16]。更有臨床研究顯示，不論接受IVF-ET治療的夫婦任何一方感染HPV，都可帶來至少40%的流產(chǎn)率，而當(dāng)雙方同時感染HPV時，流產(chǎn)率可達(dá)100%[17]。

本研究中，接受AID治療的824名女性中HPV的感染率為10.3%，與其他文獻(xiàn)報道的結(jié)論[3]相似。具體分析，呈現(xiàn)出“高危為主、型別多樣”的感染特點(diǎn)。高危型中，感染率最高的為16型，這也是臨床最早發(fā)現(xiàn)、最常見、研究最多的HPV型別[1]。除16型外，另一較常見、報道較多的高危型18型在本研究患者中感染率較低，但是51、52、53、58等型別感染率較高，其原因還有待進(jìn)一步的流行病學(xué)研究。低危型呈現(xiàn)出“感染率低、型別單一”的特點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)2種及以上低危型的混合感染。

從妊娠結(jié)局來看，HPV陽性組臨床妊娠率略高于HPV陰性組，活產(chǎn)率及持續(xù)妊娠率略低于HPV陰性組，但均無顯著性差異(P>0.05)。不良妊娠結(jié)局中，除異位妊娠率和生化妊娠率外，其余指標(biāo)HPV陽性組均高于HPV陰性組，其中晚期流產(chǎn)率HPV陽性組顯著高于HPV陰性組(6.9% vs.0.9%，P=0.007)。雖然本研究中兩組研究對象的樣本量相差較大可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響，但對HPV感染之外的各項妊娠結(jié)局影響因素進(jìn)行二分類統(tǒng)計檢驗，結(jié)果顯示HPV陽性組與HPV陰性組間各項參數(shù)指標(biāo)均在正常范圍，差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此之前提到的女方年齡、不孕年限、排卵情況等因素均未給HPV陽性組與HPV陰性組妊娠結(jié)局帶來明顯影響，對結(jié)果的統(tǒng)計分析影響亦較小。提示在忽略樣本量及其它未知影響因素的情況下，女方HPV感染有降低活產(chǎn)率、增加流產(chǎn)率的風(fēng)險，尤其是晚期流產(chǎn)率，繼而影響AID妊娠結(jié)局。2006年Henneberg等[18]通過鼠胚實(shí)驗證實(shí)，暴露在16及18型HPV DNA下的二細(xì)胞胚胎無法繼續(xù)發(fā)育至囊胚，若從四細(xì)胞階段開始暴露，雖有一部分胚胎可以繼續(xù)發(fā)育，但大部分胚胎的發(fā)育仍受到阻滯。但本研究中除16、18型外，尚有51、52、58等多個高危型也具有較高的感染率，這些型別是否與AID術(shù)后流產(chǎn)存在明確的關(guān)聯(lián)性，以及多型混合感染是否會進(jìn)一步增加流產(chǎn)的風(fēng)險，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道，仍需進(jìn)一步研究。此外，部分動物及人細(xì)胞水平的體外研究結(jié)果顯示，HPV感染導(dǎo)致流產(chǎn)率增高可能與使用攜帶HPV的精子授精有關(guān)[2，4，15]，但由于缺少體內(nèi)研究結(jié)果，目前尚無統(tǒng)一結(jié)論。另一方面，這些體外的分子或細(xì)胞研究也無法闡明母體HPV感染作用于胎兒發(fā)育的具體階段。雖然其具體機(jī)制尚待明確，但本研究結(jié)果至少提示有HPV感染及既往感染(尤其高危型)的女性在接受助孕治療期間應(yīng)定期關(guān)注HPV感染的進(jìn)展、復(fù)發(fā)情況，通過人工授精獲得臨床妊娠后，應(yīng)密切關(guān)注胎兒的發(fā)育情況。

綜上所述，HPV感染具有“高危為主、型別多樣”的特點(diǎn)，作為一個風(fēng)險因素，可明顯增加AID術(shù)后的晚期流產(chǎn)率。但其影響AID妊娠結(jié)局的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。